大型黄鱼(Larimichthys crocea)CD3ε单克隆抗体的开发及其T细胞体外激活功能研究

本研究针对鱼类T细胞研究中缺乏特异性CD3ε单克隆抗体(mAb)的关键问题，成功开发了大型黄鱼CD3ε mAb。通过构建表达Lc-CD3ε的NIH/3T3细胞免疫小鼠，获得能特异性识别脾脏T细胞的IgG1型抗体，证实其可激活mTORC1、MAPK/ERK和Ca2+通路。该成果为硬骨鱼T细胞免疫研究提供了关键工具，发表于《Fish》。

　　

在硬骨鱼的免疫防御体系中，T细胞介导的细胞免疫扮演着至关重要的角色。作为T细胞表面标志物的CD3ε分子，与T细胞受体(TCR)共同构成TCR-CD3复合物，负责传递抗原信号并驱动T细胞激活。然而，由于鱼类与哺乳动物CD3ε分子存在显著的结构差异，哺乳动物来源的CD3ε抗体无法识别鱼类T细胞，这一技术瓶颈严重制约了硬骨鱼适应性免疫的研究进展。以经济价值极高的大型黄鱼(Larimichthys crocea)为代表，其养殖业常受病原体威胁，但缺乏特异性研究工具阻碍了免疫防控策略的开发。

为突破这一限制，华东师范大学的研究团队成功开发出大型黄鱼特异性CD3ε单克隆抗体。研究人员首先通过逆转录病毒转染构建表达Lc-CD3ε的NIH/3T3细胞，并以此为免疫原制备小鼠单克隆抗体。经过细胞融合和筛选，获得能特异性识别脾脏CD3ε⁺、CD4-1⁺或CD8α⁺淋巴细胞群的IgG1型抗体。免疫荧光证实该抗体可结合白细胞表面，且能广泛检测脾脏、肝脏、头肾、鳃和外周血等免疫相关组织中的T细胞分布。

关键技术包括：1) 通过基因组共线性分析定位Lc-CD3ε基因；2) 采用逆转录病毒系统构建稳定表达Lc-CD3ε的NIH/3T3细胞系；3) 基于杂交瘤技术制备特异性mAb；4) 利用植物血凝素(PHA)刺激和磷酸化检测验证抗体功能。

序列、结构及系统进化分析
通过比较基因组学发现，大型黄鱼CD3ε基因位于第7号染色体，其侧翼基因与小鼠存在显著差异。SMART软件预测显示Lc-CD3ε具有典型的免疫球蛋白样结构域和跨膜区，但胞内段ITAM基序与哺乳动物存在差异，解释了物种特异性抗体的必要性。

CD3ε mAb的鉴定与功能验证
获得的mAb能特异性识别约15.4%的脾脏淋巴细胞，这些细胞共表达CD4-1或CD8α，确认为T细胞群体。PHA刺激实验显示，CD3ε⁺ T细胞中mTORC1和MAPK/ERK通路磷酸化水平显著提升。更关键的是，该mAb本身即可模拟抗原信号，诱导Ca²⁺内流并激活mTORC1和MAPK/ERK通路，证实其具有体外激活T细胞的双重功能。

讨论与意义
该研究首次在大型黄鱼中实现T细胞的精准识别与体外操控，解决了鱼类免疫学研究中长期存在的技术难题。相比此前依赖多克隆抗体或Zap70等替代标记的研究，CD3ε mAb提供了更直接的研究工具。研究还揭示了硬骨鱼T细胞激活保守性（如mTORC1通路）与独特性（如ITAM基序变异）并存的分子特征，为比较免疫学提供了新视角。该成果发表于《Fish》，不仅推动水产养殖病害防控研究，更为探索脊椎动物免疫系统的进化机制奠定了方法学基础。