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血脑屏障（BBB）功能研究需明确物种及体外模型差异。研究人员通过深度蛋白质组分析，对比人、猴、鼠脑微血管（BMVs）及培养脑微血管内皮细胞（BMECs）的蛋白质组，发现物种特异性转运蛋白差异及体外体内紧密连接蛋白表达差异，为跨物种研究提供数据支撑。
血脑屏障（Blood-Brain Barrier, BBB）如同守护大脑的 “精密城墙”，由脑微血管内皮细胞（BMECs）、周细胞和星形胶质细胞共同构成，通过紧密连接蛋白（如克劳丁 - 5claudin-5、闭合蛋白occludin）以及转运蛋白（如 ATP 结合盒转运蛋白ABC transporter、溶质载体转运蛋白SLC transporter）严格调控物质进出，对维持大脑稳态和药物脑内分布至关重要。然而，不同物种间 BBB 蛋白表达是否存在差异？体外培养的 BBB 模型细胞（如 hCMEC/D3、HBMEC/ciβ）能否真实反映体内状态？这些问题长期困扰着研究者，制约着跨物种药理研究和药物开发的准确性。
为破解这些谜团，日本熊本大学（Kumamoto University）的研究人员开展了一项跨物种、跨模型的深度蛋白质组学研究。他们从人、食蟹猴和小鼠的冷冻脑皮质中分离脑微血管（BMVs），并选取多种培养的 BMECs（包括永生化细胞系和原代细胞），利用数据非依赖采集质谱技术（DIA-MS）进行蛋白质组分析，旨在系统揭示 BBB 蛋白质组的物种特异性及体外 - 体内差异。该研究成果发表在《Fluids and Barriers of the CNS》，为 BBB 研究提供了珍贵的跨物种数据图谱。
研究主要采用以下关键技术方法：首先，通过优化的组织匀浆和密度梯度离心法从冷冻脑组织中分离 BMVs，经 Western blot 验证其纯度（克劳丁 - 5claudin-5富集，神经元标记物 PSD95 阴性）；其次，运用 DIA-MS 对 BMVs 和培养细胞进行蛋白质组分析，结合无标记定量（MaxLFQ 算法）和正交验证（如靶向绝对定量蛋白质组学 QTAP），实现对 7,000-8,000 种蛋白质的深度覆盖；最后，通过主成分分析（PCA）、聚类分析和基因本体论（GO）富集分析，解析物种间及体外 - 体内的蛋白质表达模式差异。样本来源包括商业购买的人类脑皮质、食蟹猴脑组织（经伦理审批）及实验室饲养的 C57BL/6N 小鼠。
研究结果
1. 物种间蛋白质组差异：人类与猴子更接近，小鼠差异显著
蛋白质组分析显示，人、猴、鼠 BMVs 分别鉴定出 7,149-8,274 种蛋白质。主成分分析（PCA）和聚类分析表明，人类与猴子的蛋白质组谱高度相似，而小鼠则形成独立聚类。进一步分析发现，溶质载体有机阴离子转运蛋白家族（SLCO）呈现显著物种差异：人类 BMVs 中 SLCO2B1 高表达，小鼠则富集 Slco1a4 和 Slco1c1。此外，小鼠 BMVs 中 SLC22A6/Slc22a6（有机阴离子转运蛋白 1OAT1）和 SLC22A8/Slc22a8（OAT3）表达量显著高于人和猴子，而 SLC43A3/Slc43a3（新型氨基酸转运蛋白）仅在人、猴中高表达，提示其可能在灵长类 BBB 中发挥特殊作用。
2. 体外 - 体内模型差异：转运蛋白与紧密连接蛋白表达模式迥异
对比 BMVs 与培养 BMECs 发现，氨基酸转运蛋白呈现 “体内外分工”：SLC7A5（LAT1）和 SLC3A2/Slc3a2（LAT1 辅助亚基）在体内 BMVs 中高表达，而 SLC1A5/Slc1a5（兴奋性氨基酸转运蛋白 2EAAT2）和 SLC38A9/Slc38a9（钠依赖性中性氨基酸转运蛋白）在体外细胞中更丰富。紧密连接蛋白组成差异尤为突出：克劳丁 - 5claudin-5在体内 BMVs 中占主导，而永生化细胞系（如 hCMEC/D3、HBMEC/ciβ）则高表达克劳丁 - 11claudin-11，原代 BMECs 虽更接近体内模式，但仍缺乏克劳丁 - 5claudin-5的优势表达，提示现有体外模型的紧密连接完整性不足。
3. 关键转运蛋白的跨物种验证与功能启示
通过靶向绝对定量蛋白质组学（QTAP）验证发现，ABCB1/Abcb1a（P - 糖蛋白MDR1）在小鼠 BMVs 中的表达量是人类的 2.9 倍，而 ABCG2/Abcg2（乳腺癌耐药蛋白BCRP）在猴子中表达最高，这与既往 PET 成像显示的物种间药物脑分布差异一致。值得注意的是，灵长类特异性表达的 SLC43A3/Slc43a3在人类诱导多能干细胞（iPSC）来源的 BMECs 中也显著表达，提示其可能是灵长类 BBB 中 6 - 巯基嘌呤等药物的关键转运体，为解释啮齿类模型预测人类药物脑暴露的局限性提供了分子依据。
研究结论与讨论
本研究通过跨物种深度蛋白质组分析，首次系统性揭示了 BBB 转运蛋白和紧密连接蛋白的物种特异性及体外 - 体内差异。关键结论包括：① 人类与猴子的 BBB 蛋白质组高度相似，而小鼠存在显著差异，尤其是有机阴离子转运蛋白家族（SLCO、SLC22），提示啮齿类模型在预测人类药物转运时需谨慎校正；② 体外培养的 BMECs（尤其是永生化细胞系）虽可模拟部分转运功能，但紧密连接蛋白组成（如克劳丁 - 5claudin-5缺失）和氨基酸转运模式与体内差异显著，原代细胞虽更接近体内，但仍需优化培养条件以提升模型真实性；③ 灵长类特异性转运蛋白 SLC43A3/Slc43a3的发现，为开发灵长类专属的药物脑递送策略提供了新靶点。
这些发现具有重要科学意义：首先，为跨物种 BBB 功能研究提供了首个综合性蛋白质组数据集，可作为 “分子字典” 帮助研究者选择合适的动物模型和体外系统；其次，明确了现有体外模型的局限性，呼吁开发更贴近体内环境的 BBB 模型（如三维培养、流体剪切力加载系统）；最后，揭示的物种特异性转运蛋白（如 SLC43A3/Slc43a3、SLCO2B1）为脑靶向药物设计提供了精准方向，有望减少因物种差异导致的药物开发失败。未来研究可进一步结合单细胞测序和功能验证，深入解析这些差异蛋白的调控机制及其在神经疾病和药物脑递送中的具体作用。
