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为探究强直性脊柱炎（AS）中异常骨形成机制，研究人员开展 YTHDF3 对骨间充质干细胞（BMSCs）成骨分化影响的研究。发现 AS - BMSCs 中 YTHDF3 上调，通过 m?A 修饰稳定 IL32 mRNA 促进成骨，为 AS 治疗提供新靶点。
在骨骼疾病的探索领域，强直性脊柱炎（Ankylosing Spondylitis，AS）宛如一颗难啃的 “硬骨头”，持续困扰着全球约 0.1% - 0.5% 的人群。它如同一位 “隐形的破坏者”，以脊柱关节的慢性炎症和异常骨形成为主要特征，随着病情的推进，患者可能会遭遇脊柱融合、活动受限乃至关节僵硬的困境，严重时甚至会导致残疾，给患者的生活质量带来极大的负面影响。
目前，学界对于 AS 中异常骨形成的分子机制尚未完全明晰。骨间充质干细胞（Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells，BMSCs）作为骨形成的关键前体细胞，其在 AS 中的成骨分化能力增强被认为是推动病情发展的重要因素。然而，调控这一过程的具体机制，尤其是 m?A（N6 - 甲基腺苷）甲基化阅读器 YTHDF3（YTH Structural Domain Family Protein 3）在此过程中扮演的角色，一直笼罩在神秘的 “面纱” 之下。
为了揭开这层面纱，海军军医大学长海医院的研究人员开展了一系列深入研究。他们的研究成果发表在《Journal of Translational Medicine》上，为 AS 的治疗带来了新的希望。
研究人员主要采用了以下关键技术方法：从 3 例 AS 患者（接受髋关节置换术）和 3 例股骨颈骨折患者（作为健康对照）中分离出 BMSCs；运用慢病毒转导技术来调控 YTHDF3 的表达；借助碱性磷酸酶（Alkaline Phosphatase，ALP）活性检测和茜素红染色来评估 BMSCs 的成骨分化能力；通过实时定量逆转录聚合酶链反应（qRT - PCR）、蛋白质免疫印迹（Western Blot，WB）分析和酶联免疫吸附试验（ELISA）来检测成骨标志物（如 RUNX2、SP7、BMP2、OCN）的表达；利用 RNA 测序（RNA - seq）、m?A 测序（m?A - seq）和 RNA 免疫沉淀（RIP）技术来筛选和验证下游靶点白细胞介素 32（Interleukin 32，IL32）；采用 RNA 稳定性测定和荧光原位杂交（FISH）技术来探究 YTHDF3 对 IL32 mRNA 稳定性的调控作用；最后，通过 SKG 小鼠模型进行体内验证，观察 YTHDF3 抑制对异位骨化的影响。
YTHDF3 在 AS 患者中表达上调
通过分析公共数据集 GSE25101，研究人员发现 AS 患者中 m?A 甲基化 regulators 仅 YTHDF3 表达上调。组织微阵列染色结果显示，AS 患者的滑膜和韧带组织中 YTHDF3 表达显著高于骨关节炎患者。进一步对临床分离的 BMSCs 进行检测，qRT - PCR 和 WB 结果均表明，AS - BMSCs 中 YTHDF3 的 mRNA 和蛋白水平显著高于健康对照。这一系列结果提示，YTHDF3 可能在 AS 的发生发展中发挥着重要作用。
YTHDF3 促进 BMSCs 成骨分化
慢病毒介导的 YTHDF3 过表达实验表明，过表达 YTHDF3 的 BMSCs 在成骨诱导后，ALP 活性显著增强，钙沉积量明显增加，成骨标志物 RUNX2、SP7、BMP2、OCN 的 mRNA 和蛋白水平均显著上调。相反，YTHDF3 敲低则导致 BMSCs 的成骨能力明显减弱，成骨标志物表达下调。这说明 YTHDF3 与 BMSCs 的成骨分化能力呈正相关，是促进成骨分化的重要因子。
IL32 是 YTHDF3 的关键下游靶点
通过 RNA - seq 和 m?A - seq 联合分析，研究人员筛选出 5 个候选基因，其中 IL32 的 log2 FC 值最高。进一步验证发现，YTHDF3 过表达可显著上调 IL32 的 mRNA 和蛋白水平，而 YTHDF3 敲低则导致 IL32 表达下降。在 AS 患者的外周血中，IL32 的表达也显著高于健康对照。体外实验表明，外源性添加 IL32 可以部分逆转 YTHDF3 敲低对 BMSCs 成骨分化的抑制作用，说明 IL32 是 YTHDF3 调控成骨分化的关键下游靶点。
YTHDF3 通过 m?A 依赖方式稳定 IL32 mRNA
荧光原位杂交实验显示，YTHDF3 与 IL32 mRNA 在 BMSCs 的细胞质中存在共定位，提示两者可能存在直接相互作用。RIP 实验证实，YTHDF3 可以直接结合 IL32 mRNA。m?A - seq 分析发现，YTHDF3 过表达导致 IL32 mRNA 终止密码子附近的 m?A 峰富集。双荧光素酶报告基因实验表明，YTHDF3 对 IL32 野生型报告基因的荧光素酶活性有显著抑制作用，而对 m?A 位点突变的报告基因无影响。RNA 稳定性实验显示，YTHDF3 过表达可增强 IL32 mRNA 的稳定性，而 YTHDF3 敲低则导致 IL32 mRNA 降解加速。这些结果表明，YTHDF3 通过识别 IL32 mRNA 上的 m?A 位点，直接结合并稳定 IL32 mRNA，从而促进其表达。
抑制 YTHDF3 可减轻 AS 小鼠模型的异位骨化
在 Curdlan 诱导的 SKG 小鼠 AS 模型中，尾静脉注射 AAV - shYTHDF3 可显著降低小鼠的关节肿胀评分，减少脊柱周围 YTHDF3 和 IL32 的表达。组织学染色显示，YTHDF3 敲低可减轻脊柱关节的炎症和异位骨形成，micro - CT 分析表明，敲低 YTHDF3 可降低脊柱的骨体积（BV）和骨矿物质含量（BMC）。体内实验进一步验证了 YTHDF3 在 AS 异位骨化中的关键作用。
研究结论与讨论
本研究首次揭示了 YTHDF3 在 AS - BMSCs 成骨分化中的关键作用及其分子机制。YTHDF3 通过识别 IL32 mRNA 上的 m?A 位点，稳定其 mRNA 并促进表达，进而推动 BMSCs 的成骨分化，最终导致 AS 中的异位骨形成。这一发现不仅阐明了 AS 中异常骨形成的新机制，还首次提出 YTHDF3 - IL32 轴可能成为 AS 治疗的潜在靶点。
然而，本研究也存在一定的局限性。例如，临床样本量较小，可能存在潜在的偏差；虽然在体外和体内实验中验证了 YTHDF3 的作用，但 IL32 在 BMSCs 成骨分化中的直接作用机制仍需进一步研究。未来的研究需要扩大样本量，并结合更多的临床数据来验证 YTHDF3 的诊断和治疗价值，同时深入探究 YTHDF3 在 AS 中的其他潜在作用机制。
总之，这项研究为 AS 的发病机制提供了新的见解，为开发针对 AS 的新型治疗策略开辟了新的方向。随着对 YTHDF3 和 m?A 甲基化调控机制的深入研究，有望为 AS 患者带来更有效的治疗手段，改善他们的生活质量。
