Orf132基因调控内质网应激相关凋亡影响牛结节性皮肤病病毒复制的机制研究

为解决牛结节性皮肤病病毒(LSDV)中独特基因Orf132功能未知的问题，研究人员通过构建Orf132缺失株(LSDV-△Orf132)，结合转录组学和qRT-PCR技术，发现该基因通过抑制内质网(ER)应激相关凋亡通路（CHOP-Caspase-12）促进病毒复制。研究首次揭示Orf132作为ER应激负调控因子的关键作用，为理解痘病毒宿主适应机制提供新视角。

　　

牛结节性皮肤病(LSD)是由牛结节性皮肤病病毒(LSDV)引起的一种新兴传染病，近年来在中国牛群中暴发，对畜牧业造成严重威胁。LSDV与山羊痘病毒(GTPV)同属山羊痘病毒属(Capripoxvirus)，基因组高度同源且具有交叉免疫原性。然而，LSDV基因组中存在多个独特基因，其功能尚不明确，其中Orf132因其在痘病毒家族中缺乏同源物而尤为神秘。这些基因可能参与宿主适应和毒力调控，但具体机制亟待解析。

为揭示Orf132的生物学功能，研究人员通过同源重组技术构建了Orf132缺失株(LSDV-△Orf132)，并系统比较了其与野生型病毒的复制差异。研究发现，缺失Orf132导致病毒滴度下降约10倍，表明该基因对LSDV复制至关重要。进一步的转录组分析显示，Orf132缺失显著改变了内质网(ER)蛋白加工和未折叠蛋白反应(UPR)通路相关基因的表达。通过qRT-PCR验证，Grp78、Chop和Gadd34等ER应激标志物在缺失株感染的细胞中明显上调。凋亡实验证实，Orf132缺失通过激活CHOP-Caspase-12介导的凋亡通路，导致细胞过早死亡，从而削弱病毒复制能力。值得注意的是，外源添加ORF132蛋白可有效抑制ER应激并挽救缺失株的复制缺陷。

研究主要采用以下技术方法：1) 同源重组构建LSDV-△Orf132缺失株；2) 病毒生长曲线分析；3) RNA-seq转录组测序；4) qRT-PCR验证ER应激相关基因；5) Western blot检测凋亡通路蛋白；6) TUNEL法分析细胞凋亡；7) 构建稳定表达ORF132的MDBK细胞系。

Orf132 exhibits immunogenicity
通过原核表达纯化ORF132蛋白，Western blot证实其可被LSDV阳性血清识别，表明该蛋白在感染过程中表达且具有强免疫原性。

LSDV-△Orf132 displays attenuated replication
成功构建的缺失株在MDBK细胞中复制效率显著降低，病毒滴度较野生型下降10倍，提示Orf132是维持LSDV高效复制的关键因子。

Transcriptomic regulation
RNA-seq发现444个差异表达基因，其中ER蛋白处理和UPR通路基因显著富集。例如，Hspa1a、Hsph1等热休克蛋白基因上调，表明细胞应激状态改变。

LSDV-△Orf132 activates ER stress-related apoptosis
Western blot显示缺失株感染后GRP78、CHOP和活化形式的Caspase-12蛋白水平升高，TUNEL实验证实细胞凋亡率增加，揭示Orf132通过抑制ER应激相关凋亡优化病毒复制环境。

Orf132 is a negative regulator of ER stress
在稳定表达ORF132的细胞中，缺失株诱导的ER应激标志物表达和凋亡水平显著降低，且病毒复制能力部分恢复，直接证明Orf132是ER应激的负调控因子。

该研究首次阐明Orf132通过调控ER应激平衡病毒与宿主互作的新机制：一方面抑制CHOP-Caspase-12通路延缓细胞凋亡，为病毒复制争取时间；另一方面维持ER稳态以支持病毒蛋白合成。这一发现不仅填补了痘病毒独特基因功能研究的空白，还为理解LSDV的宿主特异性提供分子基础。从应用角度看，Orf132可作为抗病毒药物设计的潜在靶点，其缺失株的减毒特性也为疫苗开发提供新思路。研究揭示的ER应激与病毒复制偶联机制，可能普遍存在于其他大DNA病毒中，具有重要理论价值。