新型 HIV-1 非核苷逆转录酶抑制剂的开发：增强耐药性和药代动力学特征

为解决现有 HIV-1 非核苷逆转录酶抑制剂（NNRTIs）耐药性问题，研究人员通过基于结构和骨架跃迁策略设计二芳基嘧啶类似物。发现 5i3 和 5e2 对野生型及耐药株有效，5i3 药代动力学良好，为抗 HIV 药物开发提供新方向。

　　艾滋病（AIDS）由人类免疫缺陷病毒 1 型（HIV-1）引起，仍是威胁全球公共卫生的最严重传染病之一。高效抗逆转录病毒疗法（HAART）虽有效遏制 HIV 传播，但病毒耐药性的迅速出现极大地影响了其临床应用。非核苷逆转录酶抑制剂（NNRTIs）作为抗 HIV 治疗的重要一类药物，因其相对高效、低毒和高特异性而广泛应用于 HAART 方案中。然而，现有 NNRTIs 面临严重的耐药性问题，尤其是单氨基酸点突变即可导致第一代 NNRTIs 如奈韦拉平（NVP）、依非韦伦（EFV）等高效耐药，第二代 NNRTIs 如埃替拉韦（ETR）和利匹韦林（RPV）虽有较高遗传屏障，但临床治疗后出现的双突变甚至三突变株仍大幅降低其抗病毒效力，如三重突变株 GH9（K101P/K103N/V108I）对 RPV 耐药超过 162 倍，对 ETR 耐药约 18 倍，对 EFV 耐药高达 12931 倍，因此迫切需要开发具有更强抗耐药性和更优药代动力学特性的新型 NNRTIs。

为应对这一挑战，研究人员开展了新型 HIV-1 非核苷逆转录酶抑制剂的研发工作，旨在通过结构优化设计出对野生型及耐药 HIV-1 毒株均有效、且安全性和药代动力学特性良好的化合物。研究涉及国内机构（如山东大学伦理委员会批准相关动物实验）的研究人员参与。

研究得出一系列重要结论，设计合成的二芳基嘧啶（DAPY）衍生化合物中，吡啶 [2,3-d] 嘧啶衍生物 5i3 和 6,7 - 二甲氧基喹唑啉衍生物 5e2 表现出优异的抗病毒活性，尤其对多重耐药株效果显著，为 HIV 治疗提供了有潜力的候选药物。该研究成果发表在《SCIENCE ADVANCES》。

研究主要采用以下关键技术方法：

• 基于结构的药物设计（Structure-based drug design）：利用 HIV-1 逆转录酶（RT）与抑制剂的共晶结构信息，指导化合物的结构优化，通过骨架跃迁策略将中心噻吩 [3,2-d] 嘧啶骨架替换为喹唑啉或吡啶 [2,3-d] 嘧啶核心，以更好占据结合口袋的化学空间。
• 体外抗病毒活性测定：在 TZM-bl 细胞中评估化合物对野生型（NL4-3）及多种耐药 HIV-1 毒株（如 GH9、p1579、p5375 等）的抑制活性，测定半数有效浓度（EC₅₀）、半数细胞毒性浓度（CC₅₀）及选择性指数（SI）。
• 耐药性筛选与基因分析：在 MT-4 细胞中通过逐步增加药物浓度对 HIV-1 野生株（IIIB）进行传代培养，筛选耐药突变株，提取病毒 RNA 并测序，分析逆转录酶基因中的耐药相关突变。
• 晶体结构分析：解析野生型及 GH9 突变型 RT 与化合物 5i3、5e2 的共晶结构，揭示化合物与 RT 的相互作用模式及抗耐药性的结构基础。
• 药代动力学（PK）与安全性评价：在 Sprague-Dawley 大鼠中进行单次静脉和口服给药，测定血浆浓度 - 时间曲线，评估化合物的清除率（CL）、半衰期（T_1/2）、口服生物利用度（F）等药代动力学参数；同时测定化合物对细胞色素 P450（CYP）酶的抑制作用及对 hERG 钾通道的毒性，评估药物 - 药物相互作用风险及心脏安全性。

化学合成与结构优化

研究人员通过一系列化学反应合成目标化合物。以市售的 2,4 - 二氯喹唑啉（1a）为起始原料，与 3,5 - 二甲基 - 4 - 羟基苄腈或（E）-3-(4 - 羟基 - 3,5 - 二甲基苯基) 丙烯腈反应生成中间体 2a 或 2f，再与 4-(叔丁氧羰基)- 氨基哌啶进行亲核取代反应得到中间体 3a 或 3f，经三氟乙酸脱保护后，与各种取代苄基氯（或溴）在碳酸钾存在下反应生成目标化合物 5a1–20 和 5f1–3。通过引入不同的芳香环和官能团（如氰乙烯基、磺酰胺基、酰胺基等），优化化合物的结构，以提高与 RT 的结合亲和力和抗耐药性。

抗 HIV 活性评价与构效关系（SAR）分析

所有目标化合物均在 TZM-bl 细胞中评估了对野生型 HIV-1（NL4-3）的抗病毒活性和细胞毒性。结果显示，喹唑啉衍生物 5a1–20 对 NL4-3 的 EC₅₀值在 1.42 至 38.1 nM 之间，其中带有亲水基团（如 - SO₂NH₂、-CONH₂、-SO₂CH₃）的化合物表现出更强的活性，如 5a1（EC₅₀=1.62 nM）、5a2（EC₅₀=1.82 nM）和 5a4（EC₅₀=1.42 nM）。在后续的结构优化中，引入吡啶 [2,3-d] 嘧啶骨架的化合物 5i3 表现出最优活性，对 NL4-3 的 EC₅₀=1.16 nM，且对 GH9 等多重耐药株的 EC₅₀值低至 11.1 nM，显著优于 ETR（104 nM）和 RPV（1707 nM）。构效关系分析表明，在耐受区 I 引入亲水基团、在耐受区 II 引入含氮杂环（如吡啶环）并结合氰乙烯基以增强 π-π 堆积相互作用，可显著提高化合物的抗病毒活性和抗耐药性。

耐药性筛选与基因突变分析

在药物选择性压力下，对 HIV-1 野生株（IIIB）进行 39 次传代培养，筛选出对 5e2 和 5i3 耐药的突变株（5e2^res和 5i3^res）。基因分析显示，5e2^res株在传代过程中先后出现 V179D、L100I 等突变，而 5i3^res株则携带 V106I、V179D、Y181C、A98G 和 G333E 等突变。其中，V106I、V179D 和 Y181C 为直接导致耐药的主要突变，A98G 和 G333E 为维持 RT 功能和病毒适应性的次要突变。值得注意的是，5i3 在 39 次传代后才筛选出耐药株，显示出其较高的遗传屏障，而 5e2 在 13 次传代后即出现耐药突变，表明 5i3 的抗耐药性更强。

共晶结构分析与抗耐药性机制

通过解析野生型及 GH9 突变型 RT 与 5i3、5e2 的共晶结构，揭示了化合物抗耐药性的结构基础。在野生型 RT 中，5i3 和 5e2 的左翼通过疏水作用楔入 RT 的隧道区域，与 P95、Y181、Y188 等残基相互作用；右翼通过氢键与 K101 的主链羰基和酰胺结合，并与 L100、Y318 等形成疏水接触。在 GH9 突变型 RT 中，尽管 K101P、K103N 和 V108I 突变改变了 NNIBP 的氢键网络和构象，但 5i3 和 5e2 通过构象灵活性和位置适应性调整，仍能与突变型 RT 保持有效结合。例如，5i3 的吡啶 [2,3-d] 嘧啶环上的氮原子通过水介导的氢键与 K103 相互作用，而其右翼的哌啶 - 芳基取代基导致 NNIBP 的 “屋顶” 区域扩张，允许化合物在突变株中进行更灵活的构象调整，从而维持结合亲和力。相比之下，RPV 因右翼结构较小，无法有效适应突变株的构象变化，导致对 GH9 株的抑制效力显著下降。

药代动力学与安全性评价

5i3 的药代动力学研究显示，其口服生物利用度（F）高达 59.9%，显著优于 ETR（7.17%）；静脉注射后清除率（CL）为 20.6 ml/min?kg，半衰期（T_1/2）为 1.59 小时，口服后达峰时间（T_max）为 0.417 小时，曲线下面积（AUC_0?inf）为 10033 ng?hour/ml，表明其体内吸收迅速且暴露量较高。安全性方面，5i3 对 CYP450 酶（如 CYP2C9、CYP2C19、CYP3A4）的抑制作用显著低于 ETR 和 RPV，降低了药物 - 药物相互作用的风险；对 hERG 钾通道的半数抑制浓度（IC₅₀）为 1.48 μM，心脏毒性风险与 RPV 相当但优于前期先导化合物 K-5a2 和 25a。急性毒性实验中，小鼠口服 800 mg/kg 的 5i3 后无死亡或异常行为，体重正常增长，显示出良好的安全性。

结论与讨论

本研究通过基于结构的药物设计和骨架跃迁策略，成功开发了新型 DAPY 衍生的 NNRTIs，尤其是化合物 5i3，其对野生型和多重耐药 HIV-1 毒株均表现出高效抑制活性，具有较高的遗传屏障、良好的药代动力学特性和安全性。共晶结构分析揭示了 5i3 通过构象灵活性和位置适应性克服耐药突变的分子机制，为抗 HIV 药物设计提供了新的思路。此外，5i3 与 RPV 无重叠耐药谱，有望在 HAART 方案中联合使用以最大限度抑制高度变异的 HIV 毒株。尽管 5i3 的半衰期较短可能限制其每日一次给药的潜力，但通过制剂优化或结构修饰有望进一步改善。综上所述，5i3 作为一种高效、低毒且具有抗耐药性的新型 NNRTI 候选药物，展现了良好的临床转化前景，为 HIV 治疗提供了重要的新策略。