编辑推荐：
本文利用 EdU、EU 标记及 DNAscope、RNAscope 等技术，证实非洲猪瘟病毒（ASFV）DNA 复制和转录均局限于细胞质，无核阶段参与。明确其单复制周期约 9 小时，为 ASFV 复制机制解析及抗病毒药物研发提供关键依据。
摘要
非洲猪瘟病毒（ASFV）作为核质大 DNA 病毒成员，曾被认为 DNA 复制存在核阶段。本研究以 ASFV II 型毒株 HN09 为模型，通过病毒生长动力学、电镜、定量 PCR（qPCR）等分析其生命周期早期事件。发现单复制周期约 9 小时，早期 mRNA 转录在病毒与宿主细胞孵育后 0.5 小时左右发生，远早于以往认知；病毒 DNA 复制在感染后（hpi）4-5 小时，与早期病毒工厂（VF）形成同步，随后 6-9 小时进行病毒形态发生。通过 EdU 标记、DNAscope 原位杂交结合 3D 重建追踪病毒基因组及新合成 DNA，显示病毒 DNA 始终位于细胞质。针对三种早期 mRNA（CP204L、F334L、H359L）的 RNAscope 转录研究及新生病毒 RNA 的 EU 标记，结果显示其定位相似。用小干扰 RNA（siRNA）或化学抑制剂破坏核质穿梭，不影响 ASFV 复制，而猪伪狂犬病病毒（PRV）复制显著减少。研究提供了强有力证据，表明 ASFV DNA 复制不涉及核阶段，为 ASFV 复制生物学提供了深刻见解。
重要性
ASFV 对全球养猪业构成毁灭性威胁，其基因组大（170-200 kb）、病毒体结构复杂，转录 / 复制级联协调机制尚不明确。本研究利用 EdU 和 EU 标记、DNAscope 和 RNAscope、3D 重建及 RNA 干扰（RNAi）等现代技术，证明 ASFV 生命周期不涉及核阶段，病毒转录和 DNA 复制均局限于细胞质，为 ASFV 复制生物学及抗病毒药物开发靶点寻找提供了重要见解。
引言
非洲猪瘟（ASF）是家猪的高度传染性疾病，死亡率高达 100%，是全球猪肉生产可持续发展的最严重挑战。ASFV 于 1921 年在肯尼亚首次发现，后三次传播出非洲至欧洲，2018 年抵达亚洲，造成巨大经济损失，目前欧亚多国呈地方流行。ASFV 是大型双链 DNA 病毒，为非洲猪瘟病毒科唯一成员，系统发育上属于核质大 DNA 病毒进化枝，与痘病毒等有一定共同特性。ASFV 对单核细胞 / 巨噬细胞谱系有特殊趋向性，可通过多种途径进入巨噬细胞，病毒颗粒需运输至晚期内体，低 pH 可能促进脱壳，随后释放核样层，启动病毒工厂组装。20 年前有报道称 ASFV DNA 复制存在短暂核阶段，但 ASFV 编码完整的 DNA 复制 / 转录系统，包装复杂酶类，短时间核 DNA 合成及转运似乎并非高效策略。本研究利用多种技术重新审视 ASFV 生命周期早期事件，发现 ASFV 在原代巨噬细胞中基因组 DNA 复制无核阶段，病毒 DNA 和 RNA 始终存在于细胞质，且 mRNA 转录时间比以往认为的早得多。
结果
感染 PAMs 中 ASFV 的复制动态
以基因型 II 强毒株 HN09 为模型，其在原代猪肺泡巨噬细胞（PAMs）中生长良好，在 MOI1.0时，24-36 hpi 通过终点稀释法（TCID50）达到复制平台期。详细时程分析显示，病毒滴度在 6 hpi 前逐渐下降，9 hpi 左右开始上升。透射电子显微镜（TEM）分析显示，输入病毒颗粒在与宿主细胞孵育后前 2 小时内可见，位于内体样区室，3-5 hpi 消失；最早可见的病毒工厂（VF）在 4-5 hpi 出现，6 hpi 左右出现代表病毒体初始组装的小新月体，9-12 hpi 可见大量成熟病毒颗粒，与病毒生长动力学一致。qPCR 分析显示，病毒 DNA 合成在 4 hpi 左右开始，5 hpi 时明显积累，ASFV 株 HN09 单复制周期约 9 小时，可按时间顺序区分病毒进入、病毒工厂形成 / DNA 复制（4-5 hpi）、病毒体组装（6 hpi）等不同阶段。测量 VF 与细胞核的位置关系，6-12 hpi 时两者平均距离为 1.6 μm，表明 VF 不一定靠近细胞核。
通过 EdU 标记揭示细胞质中的输入和复制 DNA
若 ASFV DNA 复制有短暂核阶段，应在 6 hpi 前发生。用 EdU 标记 ASFV 基因组 DNA，EdU 标记的 ASFV 感染组中，信号（病毒基因组 DNA）在整个时程（0-6 hpi）中仅位于 PAMs 细胞质。用 EdU 标记复制的病毒 DNA，p30 蛋白在 2 hpi 左右可检测到，持续整个病毒生命周期，EdU 阳性信号（复制 DNA）直到 4 hpi 才可见，与 VF 建立时间一致，信号在细胞质呈点状模式，为 VF 特征，细胞核未观察到该模式。PRV 感染的 PAMs 中，EdU 阳性信号在细胞核可见。统计显示，ASFV 感染细胞中 EdU 信号主要位于细胞质（>98%），6 hpi 后不到 2% 的细胞中可疑的核周 EdU 信号靠近细胞核膜，与部分 VF 靠近细胞核的观察一致。
通过原位杂交和 3D 重建揭示细胞质中的病毒 DNA
EdU 标记无法区分病毒 DNA 与宿主 DNA，采用 DNAscope 原位杂交技术，设计针对 ASFV 基因组 DNA 负链不同区域（F334L、B646L、H359L）的探针。若 ASFV DNA 有核阶段，这些区域信号应在细胞核呈阳性，但结果显示三个区域的杂交信号在整个时程中均位于细胞质，3D 重建进一步确认信号与细胞核的物理位置关系。极少数细胞（1%-3%）中，基因组 DNA 与宿主核膜紧密接触，可能是由于病毒 VF 靠近细胞核及核膜局部弯曲，经 3D 重建分析确认。结合免疫荧光染色，ASFV DNA 杂交信号在核膜外，不在核内。综上，ASFV DNA 未进入宿主细胞核，以扩散方式复制。
ASFV RNA 分布于细胞质
研究复制周期早期新合成 RNA 的分布模式，CP204L 是早期基因，编码病毒复制必需的 p30 蛋白，p30 蛋白在 2 hpi 即可检测到，RT-qPCR 显示 CP204L mRNA 在前 6 小时稳定增加，表明该基因转录至少在 ASFV 早期是连续过程。若 ASFV DNA 在某些阶段进入细胞核，该早期 mRNA 也应出现在核区室，但整个时程研究中，CP204L mRNA 杂交信号仅在细胞质。0 hpi（本实验中病毒在 37°C 孵育 1 小时定义为 0 hpi）时，部分细胞可检测到 CP204L mRNA 信号，37°C 1 hpi 时更明显，随感染进展信号更强，呈离散点状模式。用 4°C 孵育 1 小时使病毒吸附，再升温至 37°C 允许病毒进入，内吞后 30 分钟即可检测到 p30 mRNA，表明 CP204L 是即刻早期基因。设计针对早期基因 F334L 和 H359L mRNA 的另外两个探针，其杂交信号在 1 hpi 左右出现，也在细胞质呈离散点状模式，统计显示 > 97% 信号在细胞质，<3% 信号在细胞质与细胞核界面，罕见细胞核有少量信号，可能是扩散误差或核孔破坏。RT-qPCR 验证了 F334L 和 H359L mRNA 的积累。用 EU（5 - 乙炔基尿苷）标记新生 RNA，模拟感染细胞中 EU 信号主要在细胞核，ASFV 感染细胞中，p30 蛋白染色阳性细胞的细胞核 EU 信号稳定下降，细胞质信号在 2 hpi 左右出现，呈离散点状模式，表明细胞质有活跃转录，PRV 感染细胞未观察到类似现象，提示 ASFV 感染可能关闭宿主 mRNA 转录。
干扰核运输功能不影响 ASFV 复制和 DNA 定位
核质穿梭需要输入蛋白和核孔复合体（NPC）相关蛋白，若 ASFV 基因组有核阶段，病毒 DNA 在核质间穿梭是必要的，破坏其功能会对 ASFV 复制产生负面影响。用 exportin 依赖的核输出抑制剂莱普霉素 B（LMB）研究对病毒生长的影响，LMB 处理抑制 PRV 蛋白 US3 在转染 WSL-R4 细胞中的核质穿梭，未处理细胞中 US3 主要在细胞质，LMB 处理导致 US3 在细胞核显著积累。LMB 处理导致 PRV 复制显著减少，对 ASFV 无明显影响，CP204L mRNA 细胞质积累正常，新生和总病毒 DNA 在细胞质积累也无差异。用 siRNA 敲低 WSL-R4 细胞中关键输入蛋白（KPNA、KPNB）和 NPC 相关蛋白，RT-qPCR 显示 siRNA 干扰效率高，mRNA 水平显著降低。RNA 干扰（RNAi）敲低对 ASFV 复制无影响，但敲低输入蛋白 -β（KPNB）选择性抑制 PRV 复制。综上，核质穿梭不影响病毒 DNA 定位和复制区室。
讨论
ASFV 是养猪业猪死亡的首要病原体，其作为具有复杂病毒体结构的大型 DNA 病毒，复制生物学尚不清楚，限制了对病毒 pathogenesis 的进一步了解。ASFV DNA 复制是否需要核阶段是最具争议的话题之一。本研究利用现代技术（如 DNAscope、RNAscope、3D 重建、EdU 标记、RNAi 等）表明，ASFV DNA 复制和转录仅在细胞质发生。此外，病毒 mRNA 转录比想象的早得多，病毒与宿主细胞孵育后约 0.5 小时即可检测到，病毒 DNA 复制在 4-5 hpi，随后 6-9 hpi 进行病毒体组装，ASFV 单生命周期的不同阶段可及时区分，这些发现对理解 ASFV 生物学和发病机制具有重要意义。
早期关于细胞核重要性的研究主要通过两种方法进行，一是用细胞松弛素 B 处理 Vero 细胞去核，虽导致 ASFV 复制显著抑制，但细胞松弛素 B 已知对微管聚合及细胞质中其他分子有显著影响，可能对病毒复制机制有直接作用；二是用地高辛标记的病毒 DNA 探针进行原位杂交，这些研究是二维分析，缺乏 3D 重建等复杂分析，导致病毒基因组 DNA 精确定位不足，且 ASFV 感染能够扭曲或破坏核膜，可能导致部分探针信号定位错误，仔细观察发现，许多被认为在细胞核的信号实际上靠近扭曲或凹陷的核膜。
本研究提出的完全细胞质 DNA 复制有三条证据支持。利用 EdU 标记和 DNAscope 分析对病毒基因组 DNA 的时程追踪提供了最直接的证据，通过病毒生长曲线、电镜和 RT-qPCR 分析对 ASFV 单生命周期持续时间的剖析及早期 RNA 转录、DNA 复制和病毒体组装不同阶段的定义，使我们能够选择特定时间点（前 6 小时）追踪病毒 DNA 的物理位置，发现 ASFV DNA 复制与 4-5 hpi 时 VF 的建立同步，病毒 DNA 始终留在细胞质，统计分析和 3D 重建进一步证实。第二条证据来自追踪病毒 RNA 合成及相关分布模式，选择编码 p30 的 CP204L mRNA 作为指标，其在 ASFV 复制周期中高度丰富并持续高水平产生，但未观察到 CP204L mRNA 在细胞核存在，F334L 和 H359L mRNA 也是如此。用 EU 标记整体新生 RNA 转录本，初始标记仅为宿主 RNA，随感染进展，在细胞质中观察到点状 RNA 焦点，不在细胞核，表明活跃的病毒 RNA 合成，同时细胞 mRNA 显著减少，提示 ASFV 关闭细胞 RNA 合成。第三条证据来自遗传学和药理学方法，病毒若在细胞核进行 DNA 复制，必须将基因组传递到宿主细胞核，大于 39 nm 的病毒分子核输入是通过 NPC 严格调控的过程，如乙肝病毒衣壳以输入蛋白 -α 和 -β 依赖的方式结合并穿过 NPC，单纯疱疹病毒 1 型衣壳以特定方向通过结合 Nup358 停靠在 NPC 细胞质丝上，腺病毒衣壳通过结合 Nup358 和 Nup214 解体并将基因组传递到细胞核，以往研究显示 PRV 聚合酶通过与输入蛋白 α3 和输入蛋白 β1 相互作用进入细胞核。与上述结果一致，敲低一些输入蛋白和 NPC 相关蛋白对 PRV 有影响，对 ASFV 无影响，LMB 处理导致 PRV 生长滴度显著降低，对 ASFV 无明显影响。综上，研究结果与 ASFV 编码完整复制系统的最新全基因组生物信息学分析一致，因此，ASFV 采用与痘病毒类似的策略在细胞质中复制。
材料和方法
包括细胞和病毒、抗体和试剂、透射电子显微镜、EdU 或 EU 标记、间接免疫荧光测定、病毒感染和滴定、定量实时 PCR、DNAscope 或 RNAscope 原位杂交、RNA 干扰测定、LMB 处理、统计分析等内容，详细描述了实验中使用的细胞、病毒株、试剂、技术方法及操作流程等。
