核苷酸基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱技术快速检测结核分枝杆菌利福平耐药性：与表型药敏试验及DNA测序的对比研究

这篇研究通过对比核苷酸基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF MS）、表型药敏试验（DST）和DNA测序，验证了MALDI-TOF MS在结核分枝杆菌（M.tb）利福平（RIF）耐药性检测中的高效性。结果显示其灵敏度达93.2%，特异性98.1%，且能精准识别异质性耐药（heteroresistance），为临床快速诊断耐药结核病（MDR-TB/RR-TB）提供了可靠工具。

　　

ABSTRACT

利福平（RIF）耐药性是结核病（TB）防控的关键挑战，其机制主要与结核分枝杆菌（M.tb）的rpoB基因突变相关。本研究采用核苷酸基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF MS）技术，对210例M.tb临床分离株（107例敏感，103例耐药）进行检测，并与表型药敏试验（DST）和DNA测序对比。结果显示，MALDI-TOF MS的灵敏度为93.2%，特异性98.1%，总体准确率95.7%，与DST的一致性（Kappa值=0.91）和测序结果吻合度（93.4%）均表现优异。该技术尤其擅长识别rpoB基因450、445和435密码子的高频突变，并成功检出14.3%的异质性耐药病例，凸显其在耐药结核病早期诊断中的潜力。

INTRODUCTION

结核病仍是全球重大公共卫生威胁，2023年新增病例达1080万例。利福平耐药结核病（RR-TB）和多药耐药结核病（MDR-TB）的流行加剧了治疗难度。传统表型DST虽为金标准，但耗时长（数周至数月）且技术复杂。分子诊断技术如线性探针和实时荧光定量PCR（qPCR）虽提速明显，但存在假阳性或无法识别异质性耐药的局限。MALDI-TOF MS作为新兴技术，通过分析离子质荷比（M/Z）实现基因型快速检测，兼具高通量、低成本优势，但其在临床中的标准化应用仍需验证。

MATERIALS AND METHODS

研究纳入210例M.tb临床分离株，通过L-J培养基表型DST确定耐药性。DNA提取后，采用单对PCR引物扩增rpoB基因81 bp的RIF耐药决定区（RRDR），结合13条单碱基延伸（SBE）引物进行MALDI-TOF MS检测。质谱结果通过Sanger测序验证，统计分析采用MedCalc和SPSS软件。

RESULTS

1. 检测效能：MALDI-TOF MS对RIF耐药的敏感性和特异性分别为93.2%和98.1%，阳性预测值（PPV）达98.0%。
2. 突变谱：84.5%的耐药菌株携带450（54.4%）、445（19.4%）或435（10.7%）密码子突变，其中Ser450Leu（TCG→TTG）最常见（52.4%）。
3. 异质性耐药：14.3%的耐药株存在野生型与突变型共存现象，如His445Tyr（CAC→TAC）与野生型混合信号。
4. 测序验证：61例样本中，93.4%的MALDI-TOF MS结果与测序一致，但少数双突变未被完全覆盖。

DISCUSSION

MALDI-TOF MS的高精度源于其单碱基延伸原理，可区分1 Da的分子量差异。技术优势包括：

• 快速性：单次运行可处理384样本，远快于传统DST。
• 灵活性：可定制引物覆盖新突变位点。
• 临床价值：检出异质性耐药有助于优化个体化治疗方案。

局限性包括未覆盖rpoB全部突变（如Gln429His）及非RRDR区域耐药机制。未来需扩展至其他抗结核药物（如异烟肼、氟喹诺酮类）的耐药检测。

结语

本研究证实MALDI-TOF MS是结核病耐药诊断的高效工具，其与测序相当的一致性、快速报告能力和异质性耐药检出优势，为遏制MDR-TB传播提供了关键技术支撑。