单细胞重水标记技术：拉曼光谱与纳米二次离子质谱的对比研究及其在微生物代谢分析中的应用

本研究通过对比拉曼光谱（Raman）与纳米二次离子质谱（NanoSIMS）在单细胞水平检测重水（2H2O）标记的效能，揭示了两种技术的高度一致性（R2≥0.97），并优化了2H定量算法。研究为微生物代谢活性研究提供了跨技术可比性框架，解决了稳定同位素标记（SIP）数据解读的争议，推动了单细胞分辨率的微生物组学研究。

　　

引言

微生物活动驱动着全球生物地球化学循环和生态系统功能，而稳定同位素标记（SIP）技术通过追踪重同位素（如²H、¹³C）在生物量中的掺入，成为研究单细胞代谢活动的利器。其中，重水标记因其通用性备受青睐，但如何准确量化其掺入水平仍存争议。拉曼光谱（Raman）和纳米二次离子质谱（NanoSIMS）是两种主流技术，前者通过分子键振动红移检测同位素，后者通过离子束溅射获取空间分辨同位素信息。然而，两者在灵敏度、空间分辨率和分子特异性上各具优劣，且此前缺乏直接比较研究。

实验设计与方法

研究以大肠杆菌K12为模型，在含0%、15%、30%和50% ²H₂O的培养基中培养，通过化学固定和DAPI染色后，采用关联工作流程对543个单细胞进行Raman和NanoSIMS分析。Raman光谱预处理测试了截断范围（250-3,200 cm^?1或1,800-3,200 cm^?1）及四种基线校正方法（ALS、多项式拟合、滚动球、SNIP），最终选择SNIP法以最小化数据失真。NanoSIMS则比较了²H/¹H、¹²C²H/¹²C¹H和¹²C₂²H/¹²C₂¹H三种质量比，以评估不同离子对的检测效能。

关键发现

同位素比值质谱验证
0% ²H₂O组脂质的δ²H值与VSMOW标准一致，证实Raman和NanoSIMS观测到的"高背景"为技术假象，非真实生物富集。

拉曼预处理优化
光谱预处理方法对²H定量影响有限，但截断至1,800-3,200 cm^?1可减少指纹区干扰。SNIP基线法因边缘失真最小成为首选，尤其适用于低荧光样本如纯培养菌。

NanoSIMS离子对比较
²H/¹H背景最低但斜率偏低（IMF约-380‰），而¹²C₂²H/¹²C₂¹H因更高计数率和更低背景成为¹²C²H/¹²C¹H的可行替代。DAPI染色导致²H信号稀释12.8%，凸显样本处理对单细胞同位素测量的影响。

技术相关性
Raman与NanoSIMS的²H定量高度一致（R²=0.98），但斜率差异反映技术偏差：Raman高估²H含量（斜率>1），而¹²C²H/¹²C¹H质量比在低浓度时偏差显著。通过二阶导数法优化拉曼波数范围（如2,040-2,300 cm^?1→2,100-2,250 cm^?1），可进一步提升数据等效性。

应用与局限

Raman适合快速筛查C-H键（检测限>0.2%），而NanoSIMS的²H/¹H检测限低至0.04%，但可能包含可交换氢的干扰。研究建议根据实验目标选择技术：

• 高灵敏度需求：优先NanoSIMS ²H/¹H
• 分子特异性：选择Raman或¹²C₂²H/¹²C₂¹H
• 多元素分析：NanoSIMS多离子对同步检测

结论

该研究首次建立Raman与NanoSIMS在单细胞SIP中的定量桥梁，为微生物代谢异质性研究提供了方法学标准。未来工作需开发有机²H标准以校准仪器质量分馏，并探索深度分辨的亚细胞同位素分布。这项成果不仅推动微生物生态学研究，也为癌症代谢、抗生素耐药等医学领域提供了单细胞代谢成像的新思路。