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该研究开发并验证了一种多重 PCR 检测技术，可在单管反应中靶向 IS6110 和 rpoB 基因，同步检测结核分枝杆菌（M. tuberculosis）及 23 种非结核分枝杆菌（NTM）。其具高灵敏度、特异性及快速等优势，为临床鉴别诊断提供新方案，助力优化治疗策略。
研究背景与目的
结核病（TB）由结核分枝杆菌复合群（MTBC）引起，全球负担重，2023 年中国新发病例约 74.1 万。非结核分枝杆菌（NTM）感染临床症状与 TB 相似，二者鉴别困难，尤其在痰涂片阴性样本中。传统方法如涂片镜检灵敏度低（20–60%），培养耗时长，易导致误诊和治疗延误。本研究旨在开发一种快速、准确鉴别结核分枝杆菌（M. tuberculosis）与 NTM 的分子诊断方法，以满足临床需求。
材料与方法
研究设计与样本
研究分两阶段，首先开发多重 PCR 检测方法，随后在长沙市第一医院开展前瞻性单中心临床可行性研究。2023 年 2 月至 10 月，纳入 96 例痰涂片阴性疑似肺结核患者，排除曾患 TB、肺癌或 HIV 感染者。患者提供痰标本，进行涂片镜检、分枝杆菌培养、DNA 测序、Xpert MTB/RIF 检测及多重 PCR 检测。
检测方法
多重 PCR 检测靶向 M. tuberculosis 的 IS6110 基因和 NTM 的 rpoB 基因，使用 TaqMan 探针，通过不同荧光通道区分目标。DNA 提取采用自动化仪器，反应体系 25 μL，包含 Hot-Start Taq DNA 聚合酶等成分，反应条件经优化，总时长约 3 小时。以临床诊断结合培养结果为参考标准，评估检测性能。
结果
分析性能
多重 PCR 检测线性动态范围为 10?–103 copies/mL，检测下限（LOD）为 103 copies/mL。批内变异系数（CV）为 0.05–1.18%，批间 CV 为 0.08–2.57%，显示高精密性。特异性测试中，对 15 种非目标细菌无交叉反应，内参基因 RHOG 确保样本有效性。
临床可行性
在 96 例患者中，60 例诊断为肺结核（PTB），7 例为 NTM 肺炎，29 例为其他下呼吸道感染（LRTI）。多重 PCR 检测 M. tuberculosis 的灵敏度为 73.33%（44/60），特异性 100%；检测 NTM 的灵敏度 100%（7/7），特异性 94.33%。与 Xpert MTB/RIF 相比，多重 PCR 在部分培养阴性病例中检测到阳性结果，显示更高灵敏度。此外，成功识别 1 例 M. tuberculosis/NTM 混合感染。
讨论
该多重 PCR 检测通过优化靶基因选择（IS6110 和 rpoB）和探针设计，实现单管同步检测，避免传统方法的繁琐步骤和污染风险。与其他分子检测相比，其成本低（$5 / 次）、耗时短（3 小时），适合资源有限地区。尽管存在样本量小、单中心等局限性，但在痰涂片阴性样本中表现出的高特异性和对混合感染的识别能力，显著提升了结核与 NTM 感染的诊断效率，为临床及时制定治疗方案提供依据，符合世界卫生组织（WHO）对新型诊断工具的要求。
结论
本研究开发的多重实时 PCR 检测可快速、准确鉴别痰涂片阴性样本中的 M. tuberculosis 和 NTM，具良好的分析性能和临床可行性，为结核和 NTM 感染的诊断提供了经济高效的新选择，有助于改善患者预后，支持全球 “终止 TB” 战略目标的实现。
