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该研究探讨冬虫夏草（CC）形成过程中土壤性质与微生物群落的互作机制，发现木乃伊宿主幼虫阶段（MS）土壤理化性质波动显著，酶活性改变，细菌丰富度及特定属（如 Dyella、Pseudomonas）丰度增加，微生物网络复杂但不稳定，功能预测显示几丁质分解功能上调，为人工栽培提供理论依据。
摘要
本研究全面调查冬虫夏草（CC）发育阶段的土壤性质和细菌群落，发现木乃伊宿主幼虫饲养土壤（MS）阶段关键土壤参数（pH、有机质、总磷、有效磷、钾水平）波动最显著，酶活性分析显示该阶段酸性磷酸酶和脱氢酶活性改变。16S rRNA 高通量测序表明，随 CC 发育，细菌丰富度和特定属（如 Dyella、Pseudomonas）丰度增加，微生物网络在 MS 阶段最复杂但不稳定。功能预测显示 MS 阶段几丁质分解功能显著上调，揭示 CC 形成与土壤性质和细菌网络特征密切相关。
引言
冬虫夏草是青藏高原特有的寄生真菌，寄生于宿主幼虫（Thitarodes 属），其药用价值高但野生资源因过度开发减少，人工栽培面临感染率低等挑战。土壤是宿主幼虫的栖息地和 CC 发育的保护基质，但 CC 形成过程中土壤性质和微生物群落动态变化的研究缺乏。本研究旨在明确 CC 形成是否影响土壤性质、微生物群落及网络特征，为可持续管理和人工栽培提供数据。
材料与方法
土壤样品采集
在实验室采集灭菌土壤（SS）、宿主幼虫饲养土壤（HS，木乃伊化前）、木乃伊宿主幼虫饲养土壤（MS）和菌膜土壤（PS），分两部分保存用于 DNA 提取和酶活性测量。
土壤理化性质和酶活性分析
分析 pH、有机质（OM）、总氮（TN）、总磷（TP）、总钾（TK）等理化性质，以及酸性磷酸酶（ACP）、转化酶（SC）等六种酶活性，方法基于《农业化学土壤分析》。
DNA 提取、扩增、测序和序列数据分析
使用试剂盒提取 DNA，扩增 16S rRNA 基因，测序后进行生物信息学分析，包括过滤、去嵌合体、聚类成操作分类单元（OTUs）等。
统计分析
采用单因素方差分析和 Tukey’s HSD 检验分析土壤理化性质、酶活性和微生物多样性指数，利用非度量多维标度（NMDS）分析群落组成，构建微生物共现网络并评估稳定性。
结果
土壤理化性质和酶活性变化
不同阶段 CC 显著影响土壤理化性质，MS 阶段土壤呈碱性，OM 在 HS 和 MS 阶段显著减少，TP、TK 在各阶段增加，有效磷（AP）和有效钾（AK）在 HS 阶段增加、MS 阶段骤降、PS 阶段回升。酶活性方面，ACP 在 PS 阶段较 SS 阶段增加 239.71%，SC 在 HS 阶段达峰值，脱氢酶（DHA）在 MS 阶段最低。
不同阶段土壤微生物多样性
共获得 35 门、1047 属等，MS 阶段 OTU 丰富度最高，NMDS 显示各阶段微生物群落结构差异显著，MS 阶段物种 richness（ACE/Chao 指数）和多样性（Shannon/Simpson 指数）最高，Proteobacteria、Bacteroidota 等门和 Dyella、Pseudomonas 等属在特定阶段富集。
土壤中与 CC 阶段相关的显著富集 OTU
与 SS 阶段相比，HS、MS、PS 阶段富集 OTU 数量依次为 24、109、50，MS 阶段差异 OTU 最多，14 个 OTU 在各阶段均富集，包括 Proteobacteria、Bacteroidota 等门的属。
微生物网络复杂性和稳定性
MS 阶段网络节点、链接、模块数最多，正相关性比例在 HS 阶段最高，MS 阶段网络 robustness 最低、vulnerability 最高，稳定性指标与网络复杂性显著相关。
细菌群落与土壤理化性质和酶活性的关联
Mantel 测试显示细菌群落与 TP、TK、AP、AK、OM 及 ACP、DHA、POD 酶活性显著相关，TP、TK、pH 等影响网络复杂性和稳定性。
土壤微生物群落功能预测
chemoheterotrophy 和 aerobic chemoheterotrophy 为主要功能，MS 阶段几丁质分解功能显著高于 SS 阶段，PS 阶段 chemoheterotrophy 最丰富。
讨论
CC 形成过程中土壤 pH 从酸性转为碱性，OM、TP、TK 等变化反映养分吸收和转化，ACP 和 DHA 酶活性与磷代谢和微生物代谢活动相关。微生物群落在 MS 阶段多样性最高，Proteobacteria、Firmicutes 等门和 Dyella、Pseudomonas 等属可能参与 CC 形成，网络复杂性在 MS 阶段最高但稳定性最低，与土壤性质变化相关。几丁质分解功能在 MS 阶段增强，可能与宿主幼虫外骨骼分解有关。
结论
本研究阐明了土壤性质、酶活性和微生物群落与 CC 生长发育的动态互作，MS 阶段是关键阶段，其土壤性质变化伴随微生物丰富度和多样性增加，形成复杂但不稳定的网络，功能上 chemoheterotrophy 和几丁质分解突出。研究为解析 CC 形成的分子机制和优化人工生产提供了基础数据，未来可进一步研究特定微生物类群的功能和土壤改良对微生物网络的影响。
