银-钌复合抗菌剂AGXX通过氧化应激诱导大分子损伤杀灭革兰氏阴性菌的机制研究

这篇研究揭示了新型银-钌复合抗菌剂AGXX通过产生活性氧（ROS）破坏大肠杆菌（E. coli）细胞膜完整性、引发蛋白质聚集和DNA双链断裂的多重杀菌机制。研究首次证实AGXX对尿路致病性大肠杆菌（UPEC）的杀伤作用依赖ROS生成（H2O2/O2·?），并通过转录组学发现UPEC通过上调热休克蛋白（IbpA/DnaK）和金属稳态基因（cusRS）增强耐药性。特别值得注意的是，病原菌利用多聚磷酸盐（polyP）作为分子伴侣抵抗蛋白毒性，为开发抗耐药菌感染的新型抗菌涂层提供了理论依据。

　　

AGXX的抗菌机制：从氧化应激到分子防御

AGXX formulations differ in their antimicrobial potency
研究比较了四种AGXX配方（394C/823/383/894）的杀菌效果，发现粒径1.5-2.5 μm的394C和823因更大的比表面积，在相同银-钌比例下产生更多ROS，对尿路致病性大肠杆菌（UPEC）CFT073的杀菌浓度比383低5-6.3倍。生长曲线和生存实验显示，394C在40 μg/mL即可显著抑制UPEC生长，而传统银制剂需要更高剂量。

The antimicrobial activity of AGXX is caused by ROS production
通过H₂DCFDA和DHE荧光探针证实，AGXX处理60分钟后UPEC细胞内H₂O₂和O₂^·?水平分别升高4倍和6倍。添加ROS清除剂硫脲（thiourea）完全消除了AGXX的杀菌作用，而厌氧条件下即使180 μg/mL AGXX仍保留约1 log的杀菌效果，表明ROS是主要但非唯一杀伤机制。

AGXX exposure causes significant membrane damage
碘化丙啶（PI）染色和活死细胞双标显示，40 μg/mL AGXX处理使47%的UPEC细胞膜完整性受损，荧光强度增加150倍，与多粘菌素B（PMB）效果相当。值得注意的是，亚致死浓度（10-30 μg/mL）延长处理至180分钟同样引发膜损伤，提示AGXX具有缓释作用。

AGXX causes extensive protein aggregation
利用IbpA-sfGFP报告系统首次在活菌中观察到AGXX诱导的蛋白聚集现象。37.5 μg/mL处理90分钟后，80%的UPEC细胞出现多个绿色荧光聚焦点（对照仅30%），流式检测显示荧光强度增加3倍。硫脲预处理可逆转此现象，证实蛋白聚集由ROS介导。

AGXX is genotoxic, resulting in DNA double-strand breaks
通过噬菌体Gam-sfGFP标记技术，发现37.5 μg/mL AGXX处理3小时使40%的UPEC细胞出现DNA双链断裂（对照10%），与环丙沙星（Cpx）效果相当。值得注意的是，硫脲不能减少DNA损伤，提示AGXX可能通过释放的Ag⁺直接攻击DNA而非依赖ROS途径。

E. coli pathotypes differ in their resistance to AGXX
比较研究发现，非致病性MG1655在150 μg/mL AGXX下完全生长抑制，而UPEC CFT073仍保持活力。qPCR显示MG1655中热休克基因（ibpA/dnaK）表达量显著高于CFT073，但RCS防御蛋白RcrB不参与AGXX耐药，表明UPEC存在独特的应激响应网络。

Polyphosphate protects UPEC from AGXX stress
polyP合成缺陷株（Δppk）对AGXX敏感性增加2-4个数量级，外源添加4 mM polyP或互补ppk基因可完全恢复耐药性。蛋白电泳显示Δppk菌株在AGXX胁迫下不溶性蛋白聚集增加，而dnaK转录水平升高3倍，证实polyP作为化学伴侣保护蛋白质稳态的功能。

讨论与展望
该研究系统解析了AGXX通过ROS-膜损伤-大分子毒性三联作用杀灭革兰氏阴性菌的机制，同时揭示UPEC利用polyP等独特防御策略抵抗氧化应激。这些发现为开发基于金属纳米颗粒的抗菌涂层（如导尿管）提供了新思路，而靶向polyP合成酶Ppk1可能成为增强AGXX疗效的潜在策略。