永生化牦牛杂交肾细胞系的建立与评价：为BVDV疫苗生产提供新型细胞基质

为解决高原动物细胞资源匮乏及BVDV疫苗生产细胞基质受限问题，西北民族大学团队通过hTERT和SV40-LT基因转染成功构建永生化牦牛杂交（dzo）肾细胞系NBLS。该细胞在50代次内保持二倍体核型（2n=60）和超90%存活率，对BVDV的敏感性（lgTCID50=10-6.59/0.1 mL）较原代细胞提升10倍，为疫苗研发和高原疾病抗性机制研究提供重要平台。

　　

在青藏高原独特的生态环境中，牦牛与黄牛的杂交后代——犏牛（dzo）因其优异的产奶性能和抗病能力成为重要经济畜种。然而，这类高原特有动物的细胞资源极度匮乏，严重制约了相关疫苗研发和疾病机制研究。尤其对于牛病毒性腹泻病毒（BVDV）这类严重危害畜牧业的病原体，我国疫苗生产长期依赖进口MDBK细胞系，存在批次差异大、供应不稳定等瓶颈。如何利用高原动物遗传资源开发本土化细胞基质，成为亟待解决的科研与产业难题。

西北民族大学细胞基疫苗关键技术教育部工程研究中心的研究团队在《Scientific Reports》发表论文，首次通过hTERT（人端粒酶逆转录酶）和SV40大T抗原（SV40-LT）基因协同转染，成功构建具有高原适应特征的永生化犏牛肾细胞系NBLS。该细胞在连续传代50代后仍保持稳定增殖能力（存活率>97%）和正常二倍体核型（2n=60），对BVDV的感染敏感性较原代细胞提升10倍，为疫苗生产提供了理想细胞基质。

研究采用三项关键技术：1）通过慢病毒载体系统实现SV40-LT基因高效转染（阳性率64.6%），较脂质体转染效率提升8倍；2）基于TCID₅₀（半数组织培养感染剂量）定量评估病毒敏感性；3）结合流式细胞术和染色体核型分析验证细胞稳定性。所有实验均以同一批次的犏牛原代肾细胞（F3代）为对照。

研究结果
形态学分析
NBLS细胞从F3至F50代均呈现铺路石样单层生长，但随传代出现细胞伸长（长度增加50%）和体积缩小（减少30%）的适应性改变，而hTERT单独转染的NBLT细胞在F10代即出现活力下降至62.3%。

基因稳定性分析
qPCR显示SV40-LT基因拷贝数在50代内无显著波动（P>0.05），Western blot证实其蛋白持续表达。有趣的是，免疫荧光发现SV40-LT定位于细胞质而非传统认知的细胞核，提示可能存在新型作用机制。

细胞生长特性
NBLS细胞保持27小时的平均倍增时间（PDT），与原代细胞无差异（P>0.05），而NBLT细胞倍增时间延长至44小时。流式细胞术揭示NBLT细胞G1期阻滞（>90%）和凋亡率升高（10.6%），而NBLS细胞维持正常细胞周期分布（G1/S期各约45%）。

功能验证
BVDV感染实验显示NBLS细胞（F50代）的病毒滴度达10^-6.59/0.1 mL，显著高于原代细胞（10^-5.62/0.1 mL），这种增强效应可能源于SV40-LT通过抑制ATM/p53通路削弱了宿主抗病毒防御。

该研究首次证明高原杂交动物细胞可通过病毒癌基因实现安全永生化，其创新性体现在三方面：1）建立的NBLS细胞系填补了高原畜种细胞模型的空白；2）揭示SV40-LT在反刍动物细胞中的非经典定位现象；3）为国产化BVDV疫苗生产提供符合《中国药典》要求的二倍体细胞基质。未来研究需进一步解析SV40-LT调控病毒敏感性的分子机制，并评估该细胞系的致瘤风险，以推动其在兽用生物制品领域的应用。