广谱抗β-内酰胺酶单克隆抗体的开发及其在细菌耐药性免疫检测中的应用

为解决全球日益严峻的抗生素耐药性问题，立陶宛维尔纽斯大学的研究团队通过噬菌体纳米管展示技术，开发出13种能识别AmpC β-内酰胺酶保守表位的单克隆抗体（MAbs）。这些抗体可交叉反应DHA-1、CMY-34等5类重组β-内酰胺酶，并成功检测天然CMY-34酶，表位定位显示其靶向11个氨基酸的保守区域。该研究为快速诊断β-内酰胺类抗生素耐药性提供了新型分子工具，对临床监测和流行病学研究具有重要意义。

　　

抗生素耐药性已成为21世纪全球公共卫生的重大威胁，其中β-内酰胺酶介导的耐药机制最为普遍。这类酶能水解青霉素、头孢菌素等β-内酰胺类抗生素的核心结构，导致治疗失败。在四大类β-内酰胺酶中，AmpC（Class C）尤为棘手——它们不仅存在于肠杆菌科等革兰阴性菌的染色体或质粒上，还具有高度异质性：根据β-内酰胺酶数据库（BLDB）统计，其61个家族包含超过4000种变体。更严峻的是，目前缺乏能广谱检测AmpC的标准化方法，常规PCR检测因引物设计复杂且覆盖率有限，难以应对快速变异的耐药基因。

针对这一技术瓶颈，立陶宛维尔纽斯大学生物技术研究所的Karolina Bielsk^é团队在《Scientific Reports》发表创新研究。他们利用噬菌体vB_EcoS_NBD2尾管蛋白gp39自组装的纳米管作为支架，展示AmpC β-内酰胺酶保守的17氨基酸片段（DHA-1_77-93），通过杂交瘤技术获得13株单克隆抗体。这些抗体不仅能识别5类重组β-内酰胺酶（包括DHA-1、PDC-195等），还能通过免疫沉淀捕获天然CMY-34酶，表位分析揭示其中11株抗体靶向79-89位高度保守的11肽序列。通过全内反射椭偏仪（TIRE）测定，抗体对CMY-34的平衡解离常数（K_d）达纳摩尔级（1.7-5.51 nM）。AlphaFold结构预测进一步证实其可识别14个AmpC家族的变体，为开发广谱检测试剂奠定了分子基础。

研究采用多项关键技术：1）酵母表达系统合成噬菌体gp39纳米管嵌合蛋白；2）杂交瘤技术筛选交叉反应性抗体；3）免疫印迹（WB）和免疫沉淀（IP）验证抗体与天然/重组β-内酰胺酶结合；4）合成肽库进行表位精细定位；5）TIRE分析抗体-抗原相互作用动力学；6）AlphaFold-Multimer预测抗体与未实验测试的β-内酰胺酶变体的结合潜能。

结果部分核心发现：
广谱反应性MAbs的制备与鉴定
通过间接ELISA和WB验证，11株MAbs能识别所有测试的β-内酰胺酶（包括ADC-144等MBP融合蛋白），其中MAb 5C12对rCMY-34的检测限达1.6 ng。IP实验证实MAbs可从Citrobacter portucalensis菌株裂解液中富集35 kDa的天然CMY-34。

表位图谱揭示保守靶点
重叠肽分析将MAbs分为两组：Group 1（11株）靶向79-89位保守11肽（TLFELGSVSKT），Group 2（2株）识别C端85-93位可变区域。序列比对显示，Group 1表位在DHA、ACT等14个AmpC家族中高度保守，而PDC-195和ADC-144的C端变异解释了Group 2抗体的局限性反应。

计算建模预测潜在交叉反应
基于MAb 21C12可变区序列的6000次AlphaFold模拟显示，其可结合LRA家族外的绝大多数β-内酰胺酶变体肽段，但对含亲水氨基酸（如LRA18的Asn⁶）的肽段结合不可靠。

讨论与意义
该研究首次报道了靶向AmpC β-内酰胺酶保守核心区域的广谱单克隆抗体。相较于现有检测方法（如表型试验或多重PCR），这些抗体可通过免疫学方法直接识别蛋白水平的耐药标志物，避免基因异质性带来的漏检风险。尤其值得注意的是，其识别的表位远离酶活性中心（Ser⁶⁴等关键残基），确保检测不影响细菌耐药性评估。

在应用层面，这些抗体可整合至ELISA、免疫层析或光学生物传感器（如表面等离子体共振技术）中，实现临床样本的快速筛查。鉴于WHO将β-内酰胺酶生产者列为重点防控病原体，该成果对耐药菌株的流行病学监测、抗生素合理使用指导具有重要价值。作者也指出，未来需优化抗体在诊断平台中的集成策略，并扩大其在更多AmpC变体（如FOX、MOX家族）中的验证范围。

这项由立陶宛团队主导的研究，为全球抗击抗生素耐药性提供了新型分子武器，其创新性的噬菌体纳米管展示技术也为其他难靶向抗原的抗体开发提供了范式。随着后续转化研究的推进，这些抗体有望成为临床微生物实验室对抗"超级细菌"的重要装备。