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该研究针对传统电镜评估狂犬病毒颗粒完整性的不足，开发时间分辨荧光免疫分析（TRFIA），通过检测暴露核蛋白实现实时定量分析。经多方法验证，结果与电镜一致，为疫苗质量控制提供新方案。
狂犬病是由狂犬病毒（RV）引起的严重人畜共患病，病死率接近100%，疫苗接种是关键防控手段。当前商用狂犬病疫苗均为灭活病毒制剂，病毒颗粒完整性是生产质量的关键指标，而传统基于电镜的颗粒完整性评估方法存在耗时、操作复杂、准确性有限且缺乏定量能力等不足，难以满足现代疫苗生产需求。
1. 引言
狂犬病主要通过感染动物唾液传播，全球每年超5.9万人死于该病，95%发生在非洲和亚洲，儿童是主要受害者。疫苗质量控制中，颗粒完整性评估至关重要。时间分辨荧光免疫分析（TRFIA）因特异性强、准确性高、线性范围广和操作简便等优势，在疫苗质量控制中展现出良好应用前景，其灵敏度、准确性和检测范围均优于常用的酶联免疫吸附试验（ELISA）。本研究开发了一种基于检测暴露核蛋白的新型TRFIA，用于实时定量评估狂犬病毒颗粒完整性。以抗狂犬病毒糖蛋白（G）单克隆抗体（MAb）包被微孔板捕获病毒颗粒，标记抗核蛋白（N）抗体作为信号示踪剂，经多疫苗样本分析及多种病毒颗粒破坏方法验证，结果与电镜一致。
2. 材料与方法
- 伦理声明：研究获南方医科大学实验动物伦理委员会批准，动物护理和使用符合相关指南。
- 病毒、细胞、动物和样本：灭活狂犬病毒、人用狂犬病疫苗国家标准品、细胞蛋白标准品及疫苗样本等来自中国食品药品检定研究院，重组G、N蛋白和Sp2/0细胞存于南方医科大学，6-8周龄雌性BALB/c小鼠购自该校实验动物中心。
- 试剂和仪器：牛血清白蛋白（BSA）等试剂购自Sigma-Aldrich，铕（Eu）标记试剂盒等来自广州优博生物技术有限公司，超滤离心管等来自Millipore Corp.，超纯水制备系统等来自赛多利斯等公司。
- 溶液配制：包括包被缓冲液（50mM Na?CO?-NaHCO?缓冲液，pH9.6）、封闭液、标记缓冲液等多种溶液，各有特定配方。
- 单克隆抗体制备：采用经典杂交瘤技术，以灭活狂犬病毒（PM株）免疫BALB/c小鼠，经免疫、加强免疫、采血测抗体效价后，脾细胞与Sp2/0细胞融合制备杂交瘤，筛选分泌抗G和N单克隆抗体的杂交瘤细胞，经克隆化培养后腹腔注射小鼠产生腹水，纯化获得单克隆抗体。
- 捕获抗体固定：将抗G MAb用包被缓冲液稀释后包被96孔板，4℃孵育12小时，洗涤后用含1%BSA的封闭液37℃封闭1小时，干燥后密封于-20℃保存。
- 抗体标记：按Eu3?标记试剂盒 protocol，将抗N MAb与Eu3?螯合剂混合，室温孵育18小时，经Sephadex G-50柱分离纯化，测定蛋白浓度和荧光强度，收集峰值部分，冻干后-20℃保存。
- 标准品制备：将第9批人用狂犬病疫苗国家标准品（设定每瓶暴露N蛋白值为1EU/mL）用标准缓冲液系列稀释，冻干后4℃保存，使用前用纯水复溶。
- 免疫分析设计：采用两步法，包被固定抗体和标记抗体后，加入标准品或样本孵育，形成夹心复合物，洗涤后加增强液，振荡后用DR6660检测荧光强度，超出线性范围的样本用分析缓冲液稀释。
- 优化与验证：通过方阵法优化抗体组合、捕获抗体浓度、标记抗体稀释度和反应时间等参数；通过病毒裂解缓冲液处理疫苗样本验证设计概念；绘制标准曲线，计算检测限；评估精密度、特异性、准确性，并与电镜观察结果比较。
3. 结果
- 抗体筛选与鉴定：经间接TRFIA鉴定，获得3株抗G MAbs（RG10、RG18、RG56）和4株抗N MAbs（RN03、RN19、RN42、RN44）。
- 抗体组合筛选：方阵法筛选出最佳抗体对为RG56（捕获抗体）和RN42（检测抗体），其荧光信号值最高。
- 分析系统优化：确定最佳捕获抗体浓度为3μg/mL，标记抗体稀释度为1:400，反应时间为60分钟。
- 设计概念验证、标准曲线与检测限：TRFIA（G-Mab & N-Mab）检测信号先升后降，符合预期，验证设计概念；标准曲线方程为LogY=0.86LogX+3.61（R2=0.999），检测限为0.08mEU/mL，线性范围达125mEU/mL。
- 精密度分析：批内和批间变异系数（CV）均小于10%，回收率在90%-110%之间，表明精密度和准确性良好。
- 特异性分析：在高浓度疫苗常规成分存在下，回收率在90%-110%之间，TRFIA特异性良好。
- 准确性分析：不同生产阶段疫苗样本检测结果与预期一致，经超声破碎、反复冻融、热处理和病毒裂解处理后，TRFIA能准确分析颗粒完整性变化。
- 与电镜观察比较：经10次反复冻融处理的病毒颗粒电镜下破裂严重，TRFIA检测值显著高于未处理组，结果一致，且TRFIA提供稳定定量数据。
4. 讨论
电镜评估病毒颗粒完整性直观但成本高、操作复杂，样本运输和制备过程可能引入颗粒损伤，且视野有限、工作量大、重复性差。本研究基于狂犬病毒颗粒完整时N蛋白位于内部，受损时暴露的特点，开发靶向暴露N蛋白的TRFIA，实现颗粒完整性实时定量分析。以抗G MAb捕获病毒颗粒，抗N MAb作为信号示踪剂，筛选出最佳抗体对RG56和RN42。因缺乏暴露核蛋白标准品，以第9批国家标准品作为协作校准品，初步验证适用于同一生产工艺不同阶段疫苗样本。
研究中TRFIA精密度、准确性、特异性良好，能有效监测颗粒完整性变化，结果与电镜一致，表明暴露N蛋白可作为评估颗粒完整性的可靠靶点。但该方法存在不能区分完全完整和高度破裂颗粒的局限性，且需考虑抗体特异性和毒株变异影响，必要时需结合电镜等技术。综上，本研究开发的TRFIA为狂犬病疫苗质量控制中病毒颗粒完整性的实时定量分析提供了有前景的解决方案，有望提升疫苗生产工艺和质量控制水平。
