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为解决金黄色葡萄球菌（S. aureus）感染及生物膜形成带来的治疗挑战，研究人员开展针对其丝氨酸水解酶（Fphs）的共价抑制剂筛选研究。通过高通量筛选，获得 FphB、FphE、FphH 选择性抑制剂，揭示其在生物膜形成和毒力中具独特作用，为感染防治提供新工具。
在细菌感染的世界里，金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）如同一个顽固的 “捣乱分子”，不仅是全球细菌相关死亡的主要原因之一，还擅长在人体组织或医疗设备上形成生物膜。这种生物膜就像一层坚固的 “防护盾”，能让细菌的抗生素耐药性提升 1500 倍，使得慢性感染难以根治，严重威胁人类健康。然而，目前针对其致病机制的深入研究及有效治疗手段的开发仍面临诸多挑战，尤其是如何精准靶向与毒力和生物膜形成密切相关的关键酶类。
为了攻克这一难题，斯坦福大学医学院（Stanford University School of Medicine）等机构的研究人员将目光聚焦于金黄色葡萄球菌的丝氨酸水解酶家族（fluorophosphonate-binding hydrolases, Fphs）。这类酶在脂质代谢、宿主 - 病原体相互作用中扮演重要角色，但由于家族成员结构和功能高度相似，难以区分各自具体作用。研究团队希望通过筛选特异性共价抑制剂，深入解析 Fphs 各成员的功能，为开发新型治疗和诊断工具提供依据。这项研究成果发表在《Nature Communications》上，为金黄色葡萄球菌感染的防治带来了新希望。
研究人员主要采用了以下关键技术方法：一是高通量筛选（high-throughput screening, HTS），利用包含 1600 种共价亲电片段的文库，针对 FphB、FphE、FphH 三种酶进行筛选；二是荧光酶活性测定，通过荧光底物（如 4 - 甲基伞形酮丁酸酯（4MUB）、4 - 甲基伞形酮辛酸酯（4MUC））检测酶活性变化；三是 X 射线晶体学（X-ray crystallography），解析抑制剂与酶的结合模式；四是 Galleria mellonella 感染模型，评估抑制剂在体内对细菌毒力的影响。
丝氨酸共价片段文库筛选
研究人员开发了基于荧光的高通量筛选方法，针对重组表达的 FphB、FphE、FphH 酶，优化缓冲条件、酶和底物浓度，获得了可靠的信号噪声比（Z’值 > 0.7）。利用 Echo 声学液体处理器将文库片段以纳升级体积 dispense 至 384 孔板，在 50μM 浓度下进行初筛，以抑制率≥80% 为标准，共筛选出 371 个活性命中化合物，其中 FphH 命中数最多（350 个），FphB 最少（62 个），表明 FphH 可能更易被多种亲电试剂抑制。
新型亲电试剂的鉴定
从筛选结果中选取 16 个基于效力和选择性的顶级化合物，涵盖氟硫酸盐（OSF）、磺酰氟（SF）、硼酸（boronic acid）等多种亲电类型。例如，氟硫酸盐类化合物 X13 对 FphH 和 FphE 具纳摩尔级抑制活性，其作用机制涉及在中性 pH 条件下环化形成类似糖精的活性中间体，与酶活性位点丝氨酸共价结合；磺酰氟类化合物 X20 是首个对 FphB 具选择性的不可逆抑制剂（IC50=10.1μM），jump-dilution 实验证实其共价结合特性；硼酸类化合物 Z27 和 N34 分别对 FphE（IC50=50nM）和 FphH（IC50=60nM）具高选择性和纳摩尔级 potency，晶体结构显示其通过与酶活性位点丝氨酸和组氨酸形成双共价键发挥作用。
抑制剂对细菌生长和生物膜形成的影响
在金黄色葡萄球菌野生型及 fph 基因突变株中，硼酸类抑制剂 Z27 和 N34 显示出对靶酶的选择性抑制。N34 处理可导致 fphE 和 fphH 双突变株生长缓慢，呈现双相生长模式，表明 FphE 和 FphH 可能存在功能重叠。生物膜形成实验表明，fphH 突变株的生物膜形成减少 50% 以上，N34 处理野生型细菌可显著抑制生物膜形成，而 FphH 互补菌株可恢复生物膜形成能力，证实 FphH 在生物膜形成中起关键作用。FphB 和 FphE 突变株的生物膜形成仅减少 20-30%，需更高浓度抑制剂才能进一步抑制，提示其功能可能与其他 Fphs 存在补偿效应。
体内毒力研究
利用 Galleria mellonella 感染模型评估抑制剂体内效应，结果显示 fphE、fphH、fphB 突变株感染的幼虫存活率显著高于野生型菌株（p<0.001）。Z27 处理野生型菌株可模拟 fphE 突变株的保护效果，N34 和 X20 分别对 fphH 和 fphB 突变株具类似作用，且互补菌株可恢复毒力，表明抑制 Fphs 可有效降低细菌体内毒力。此外，抑制剂对革兰氏阴性菌（如大肠杆菌、铜绿假单胞菌）无显著生长抑制作用，且在哺乳动物细胞中毒性较低，显示出一定的安全性和选择性。
这项研究通过高通量筛选结合多种生化和结构生物学技术，成功鉴定出金黄色葡萄球菌 FphB、FphE、FphH 的选择性共价抑制剂，揭示了这些酶在生物膜形成和毒力中的独特功能。研究结果不仅为解析 Fphs 家族的复杂功能提供了有力工具，也为开发针对金黄色葡萄球菌感染的新型治疗策略（如抗生物膜形成药物）奠定了基础。特别是氟硫酸盐、磺酰氟和硼酸类抑制剂展现出的高选择性和 potent 抑制活性，为后续药物优化提供了宝贵的先导化合物。未来，进一步优化抑制剂的细胞通透性和体内代谢特性，有望将其转化为临床可用的抗菌药物，为解决耐药菌感染难题开辟新途径。
