基于多重DIA-MS和pSILAC技术的蛋白质周转动态分析揭示顺铂耐药与染色体非整倍性的调控机制

本研究针对蛋白质周转定量分析中多重DIA-MS数据处理的挑战，开发了整合机器学习算法的"Labeled"（LBL）工作流程和KdeggeR分析工具。研究人员通过2通道/3通道标准数据集验证了该方法在提高检测覆盖率和定量准确性方面的优势，并应用于卵巢癌顺铂耐药模型，发现线粒体呼吸链复合物I/IV通过加速降解介导耐药性。该研究为高通量蛋白质动态分析提供了创新技术平台，揭示了蛋白质降解在非整倍性缓冲和耐药性中的双重作用。

　　

在癌症生物学领域，蛋白质周转（protein turnover）的动态平衡对细胞适应环境压力和药物耐受至关重要。然而，传统质谱技术难以精确量化复杂生物系统中数千种蛋白质的合成与降解速率，特别是在研究基因组不稳定性（如非整倍性）与化疗耐药关系时，缺乏高效可靠的分析方法。现有技术如数据非依赖性采集（DIA）质谱虽具有高重现性，但在处理脉冲稳定同位素标记（pSILAC）实验的多时间点数据时，仍面临早期标记信号弱、通道比例变化大等技术瓶颈。

针对这些挑战，来自美国耶鲁大学医学院的研究团队开发了创新的多重DIA-MS分析流程，结合机器学习算法和动态稳定同位素标记技术，成功绘制了卵巢癌顺铂耐药模型中蛋白质周转的全局图谱。这项发表于《Nature Communications》的研究不仅提供了强大的技术平台，更揭示了蛋白质降解在维持非整倍细胞稳态和促进耐药性中的双重作用。

研究团队采用三个关键技术方法：1）开发"Labeled"（LBL）工作流程，通过机器学习动态调整多通道信号提取策略；2）构建KdeggeR分析包，实现从原始数据到降解速率（k_deg）的一站式分析；3）应用该技术平台分析A2780卵巢癌细胞及其顺铂耐药株（A2780Cis）的pSILAC-DIA数据集，整合基因组和转录组数据揭示调控机制。样本来源于标准细胞系和公共数据库（GSE173201）。

研究结果部分，首先在"改进的多重DIA-MS数据集识别"中，LBL工作流程在2通道A2780稀释系列中比传统方法（ISW）多识别147.6%的前体离子和35.3%的蛋白质组，在3通道HeLa数据中重标样品（mix2）的识别率提升115.9%。通道权重直方图显示算法能自适应不同混合比例。

"通道特异性q值过滤"部分比较了三种过滤选项：GroupQ在保持高灵敏度的同时，比MaxQ多保留32.7%的早期时间点数据。与plexDIA工作流相比，MaxQ显示出更优的定量精度，而GroupQ更适合需要最大覆盖度的研究。

"KdeggeR综合分析工具"展示了该R包的三项核心功能：1）支持多种质谱平台数据输入；2）提供基于相对同位素丰度（RIA）和非线性最小二乘拟合的k_loss计算；3）实现从前体水平到蛋白质水平的加权聚合。应用实例显示MBNL1在耐药株中周转速率显著降低。

"多组学分析揭示蛋白质降解的双重作用"部分有重要发现：1）拷贝数变异（CNA）影响的蛋白质复合物亚基呈现显著mRNA-k_deg正相关（R=0.537），表明通过降解维持复合物稳态；2）DNA修复通路在"增益+放大"组富集，其蛋白质水平通过降低降解被选择性增强；3）线粒体呼吸链复合物I/IV成员（如NDUFB11）在耐药株中降解加速且丰度降低，DepMap分析证实其表达与顺铂敏感性负相关。

讨论部分强调，该研究通过技术创新解决了多重DIA-MS在动态标记实验中的定量难题，首次系统揭示了蛋白质周转在非整倍性缓冲（缓冲约50%的剂量差异）和耐药性塑造中的调控网络。特别值得注意的是，线粒体代谢重编程通过差异调控复合物亚基的降解实现，这为理解化疗耐药提供了新视角。技术层面，LBL工作流程与timsTOF Ultra平台的结合使检测深度提升30%，为单细胞蛋白质动态研究奠定基础。未来研究可进一步探索NDUFB11等关键蛋白的降解机制及其作为耐药标志物的潜力。