【文献速递】基于MMI激光显微切割+Covaris聚焦超声的脑胶质瘤空间蛋白组研究

英国曼彻斯特大学团队通过一种纳米组学整合工作流程（Nano-omics），关联GB进展相关的全身性（血浆）与局部性（肿瘤组织）蛋白质变化，成功找到了多个和 GB 相关的潜在生物标志物，为 GB 的早期检测和病情监测带来了新希望。

胶质母细胞瘤（GB）是成人中枢神经系统最常见且最具侵袭性的原发性肿瘤，患者预后差。了解GB的分子图谱，可实现更精准的患者分级，从而提供个性化治疗方案。从液体活检样本中识别外周生物标志物有可能捕获GB的空间和时间异质性，有助于改善GB诊断与治疗，但目前临床应用受限，亟待开发新的分析工具。为此，英国曼彻斯特大学Marilena Hadjidemetriou研究团队通过一种纳米组学整合工作流程（Nano-omics），关联GB进展相关的全身性（血浆）与局部性（肿瘤组织）蛋白质变化，成功找到了多个和 GB 相关的潜在生物标志物，为 GB 的早期检测和病情监测带来了新希望。相关研究内容“Plasma-to-tumour tissue integrated proteomics using nano-omics for biomarker discovery in glioblastoma”于今年4月10日发表在Nature Communications杂志上。

其中，小鼠大脑组织FFPE样本的空间蛋白组学分析以及GB患者（通过手术切除）快速冷冻肿瘤组织样本的空间蛋白组学分析都是通过MMI Cellcut激光显微切割系统进行样本获取，借助Covaris LE220-Plus聚焦超声样本处理系统超声10min进行蛋白提取，经样本前处理后进行质谱分析。

结果分析

结果一：GL261小鼠GB模型中基于纳米颗粒的血浆蛋白质组学研究

利用GL261小鼠模型，在肿瘤接种后第7、14、18天采集样本，分析脂质体纳米颗粒在体内形成的蛋白质冠。发现随着肿瘤体积增加，纳米颗粒蛋白结合值升高，且荷瘤小鼠与对照小鼠在第14、18天的蛋白结合值差异显著。通过蛋白质组学分析，确定了不同时间点荷瘤小鼠与对照小鼠之间的差异丰度蛋白（DAPs），且多数 DAPs 在荷瘤小鼠中上调，不同时间点DAPs重叠少，表明肿瘤进展过程中血浆蛋白质组存在动态变化。

图1. 利用纳米技术在GL261小鼠GB模型中的血浆蛋白质组学研究。a,血浆蛋白质组学体内工作流程示意图；b,定量脂质体纳米颗粒表面吸附的总蛋白量；c,维恩图展示在D7、D14和D18时间点鉴定出的DAPs的共有数量和特有数量；d,通过分析GB小鼠和健康对照小鼠形成的蛋白冠状层，鉴定出的上调和下调DAPs的数量及百分比；e, 火山图展示D7、D14和D18时间点DAPs的倍数变化与统计学显著性之间的关系。

结果二：GB 特异性血浆蛋白质组的纵向监测

对不同肿瘤生长阶段的GL261荷瘤小鼠体内形成的蛋白质冠进行研究，PCA 分析显示不同阶段有独特的血浆蛋白质组特征。部分DAPs丰度随肿瘤负荷增加呈现不同趋势，如第7天发现的115个DAPs丰度逐渐下降，而第18天的417个DAPs则逐渐上调。还确定了一组在三个时间点均有差异丰度的116个蛋白质，其中部分蛋白质在肿瘤负荷增加时血浆水平持续上升或下降，有作为GB监测生物标志物的潜力。

图2. 载有GL261肿瘤的小鼠脑胶质瘤特异性血浆蛋白质组的纵向监测。a、b,分别在第7天和第18天，从GB小鼠与对照小鼠中鉴定出的115种和417种DAPs的倍数变化值的纵向波动；c、d,火山图展示在第7天与第14天以及第14天与第18天时间点之间鉴定出的差异表达蛋白的倍数变化与显著性之间的关系。

结果三：血浆和肿瘤组织蛋白质组的综合分析

为评估血浆蛋白组与脑GB生长之间的关联，本研究开发了一种从血浆到肿瘤组织的蛋白质组综合分析流程。其中，针对FFPE小鼠大脑组织样本，通过MMI激光捕获显微切割（LCM）结合 LC-MS/MS 技术分析小鼠脑肿瘤组织和“健康”脑组织。结果发现肿瘤组织和“健康”组织在各时间点有大量DAPs，血浆和肿瘤组织的DAPs有显著重叠，且重叠的DAPs在血浆和肿瘤组织中的表达变化趋势多样。KEGG通路分析表明，随着肿瘤生长，血浆和肿瘤组织中共同富集的通路数量增加，如吞噬体、内质网蛋白加工、粘着斑等通路，这些通路相关蛋白或可作为GB的生物标志物，用于早期检测和病情监测。

图3. GL261荷瘤小鼠血浆和肿瘤组织蛋白质组的整合分析。a,用于脑组织样本蛋白质组学分析的LCM整合LC-MS/MS工作流程示意图；b, 火山图显示健康组织与肿瘤组织DAPs的倍数变化与显著性之间的关系；c,点图展示通过独立富集分析在D7、D14和D18时血浆和肿瘤组织DAPs中共同识别出的KEGG通路。

结果四：人脑GB中血浆与肿瘤组织整合工作流程的验证

为了对该工作流程进行临床验证，本研究使用体外纳米组学流程分析10例高级别胶质瘤患者的血浆和肿瘤组织样本。其中，利用MMI LCM结合 LC-MS/MS 技术对GB患者手术切除的快速冷冻组织进行了空间分辨蛋白组分析。分析发现，与健康对照相比，确定了321个血浆DAPs，其中约44%在肿瘤组织中也被鉴定到。通过跨物种比较，在人和小鼠的GB特异性血浆和肿瘤组织蛋白质组中确定了48个潜在生物标志物，部分已被报道与GB进展相关，还有16个为新发现的潜在生物标志物，这些发现为全面了解早期疾病检测和疾病监测提供分子基础，该工作流程未来也有望用于影响中枢神经系统的多种疾病。

图4. 血浆与肿瘤组织整合蛋白质组学分析流程的患者样本临床验证。a,患者临床队列研究思路示意图；b,火山图展示通过比较GB患者冠层与健康对照冠层所鉴定出的DAPs的倍数变化与显著性之间的关系；c,点图展示通过独立富集分析人血浆DAPs和肿瘤组织蛋白所确定的共同KEGG通路；d,弦图连接了人和小鼠共有的7条富集通路。

本研究开发的Nano-omics整合工作流程，将血浆与肿瘤组织蛋白组变化相关联，为GB生物标志物的发现提供了新途径。而MMI激光显微切割技术实现了对脑组织进行空间分辨且无偏的蛋白质组学分析，用于精准分析肿瘤组织和健康组织的蛋白组差异，有效解决样本的异质性问题。

基于MMI激光显微切割程序设置：

基于Covaris LE220-Plus质谱前样本处理的程序设置：

基于MMI激光显微切割的空间多组学方案

德国Molecular Machine & Industries (MMI)是专门致力于将显微操作技术与高精度激光技术相结合应用于生命科学领域的一家专业公司，其标志性产品MMI CellCut激光显微切割系统和CellEctor单细胞分选系统成为目前世界上性能优异的样本处理系统。基因有限公司作为MMI产品中国区合作伙伴，可为感兴趣的客户提供专业的产品咨询、技术答疑及联系试用等。

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