Western Blot技术指南——电泳篇

【字体：大中小】 时间：2025年05月20日 来源：基因有限公司

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　　Western Blot主要⽤于检测或分析蛋⽩，应⽤领域集中在基因表达研究、抗体活性检测和疾病诊断等。今天⼩编为⼤家介绍Western Blot—SDS-PAGE电泳。

蛋⽩质印迹技术（免疫印迹实验）⼜称为Western Blot。它是分⼦⽣物学、⽣物化学和免疫遗传学中常⽤的⼀种实验⽅法。Western Blot主要⽤于检测或分析蛋⽩，应⽤领域集中在基因表达研究、抗体活性检测和疾病诊断等。Western Blot整个流程可分为如下图所示：

今天⼩编为⼤家介绍Western Blot—SDS-PAGE电泳。

电泳原理

聚丙烯酰胺凝胶为⽹状结构，具有分⼦筛效应。它有两种形式：⾮变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（Native-PAGE）和SDS-聚丙烯酰胺凝胶（SDS-PAGE）；⾮变性聚丙烯酰胺凝胶，在电泳的过程中，蛋⽩质能够保持完整状态，并依据蛋⽩质的分⼦量⼤⼩、蛋⽩质的形状及其所附带的电荷量⽽逐渐呈梯度分开。⽽SDS-PAGE仅根据蛋⽩质亚基分⼦量的不同就可以分开蛋⽩质。聚丙烯酰胺凝胶电泳，普遍⽤于分离蛋⽩质及较⼩分⼦的核酸，通常采⽤垂直电泳进⾏分离。

聚丙烯酰胺凝胶的特点

聚丙烯酰胺凝胶是⼈⼯合成三维⽹状结构的凝胶，具有分⼦筛作⽤，其筛孔的⼤⼩可⼈为控制和调节，并且制备重复性好。
聚丙烯酰胺凝胶是碳-碳结构，没有或很少带有极性基因，因⽽吸附少，电荷作⽤⼩，不易和样品相互作⽤，化学性质⽐较稳定。
凝胶⽆⾊透明，适宜⽤光密度扫描记录结果，且上样量较少。
⽤途⼴泛，具有弹性，便于操作，易于保存。

由于其具有上述特点，特别适合做区带电泳的⽀持物，⽤于酶带的分离以及进⾏分⼦量的测定。

SDS-PAGE电泳各组分对电泳的影响

丙烯酰胺（Aery）单体及N,N-亚甲基双丙烯酰胺（Bis）的含量及⽐例决定了凝胶孔径的⼤⼩，影响电泳速度和分离效果。凝胶聚合过程中，Acry单体之间形成延伸的多聚链，并通过Bis的作⽤，连接和交叉成⽹状结构，最终成为⾁眼可⻅的凝胶。

催化剂过硫酸钠（APS）和加速剂四甲基⼄⼆胺（TEMED）直接影响凝胶聚合质量。⼆者加量过多，会使Acry单体聚合链较短，聚合不充分，胶的脆性增加；反之，如加量过少，则聚合速度⼤⼤降低，甚⾄只出现所配置的胶溶液黏度稍增加、⽆胶状物出现的现象。

Tris缓冲液的pH值对于电泳效果起到⾄关重要的作⽤。在SDS-PAGE不连续电泳中，制胶缓冲液使⽤的是Tris-HCl缓冲系统，浓缩胶是pH 6.7，分离胶pH 8.9；⽽电泳缓冲液使⽤的Tris-⽢氨酸缓冲系统。在浓缩胶中，其pH环境呈弱酸性，因此⽢氨酸解离少，在电场作⽤⼩，泳动效率低；⽽氯离⼦却很⾼，两者之间形成导电性较低的区带，蛋⽩分⼦就介于两者之间泳动。由于导电性与电场强度成反⽐，这⼀区带便形成了较⾼的电压梯度，压着蛋⽩质分⼦聚集到⼀起，浓缩为⼀狭窄的区带。当样品进⼊分离胶后，由于胶中pH呈碱性，⽢氨酸⼤量解离，泳动速率增加，直接紧随氯离⼦后，同时由于分离胶孔径的缩⼩，在电场的作⽤下，蛋⽩分⼦根据分⼦⼤⼩进⾏分离。

如何提高垂直电泳的分辨率

保证聚丙烯酰胺充分聚合，可提⾼凝胶的分辨率。配置凝胶在室温凝固后，可在室温放置⼀段时间使⽤。忌即配即⽤或4度冰箱放置，前者易导致凝固不充分，后者可导致SDS结晶。

根据待测蛋⽩的分⼦量⼤⼩，配置合适浓度的凝胶，可参考下图。