基于ITGA9和NGFR联合标记的人睾丸管周肌样细胞与间质细胞鉴定分离新策略

本研究针对成人睾丸间质细胞(ALCs)和管周肌样细胞(PTMs)因共同祖源导致的体外分离难题，通过单细胞转录组分析发现ITGA9和NGFR可作为特异性表面标记。上海交通大学医学院团队建立新型流式分选方案，成功实现两种细胞的高纯度分离与长期培养，证实ALCs具有睾酮分泌功能而PTMs表现血管形成特性。该研究为男性生殖障碍机制研究及细胞治疗提供了关键技术平台。

　　

男性生殖功能依赖于睾丸微环境中体细胞的支持作用，其中间质细胞(Adult Leydig cells, ALCs)负责睾酮分泌，管周肌样细胞(Peritubular myoid cells, PTMs)则通过收缩功能参与精子运输。这两种细胞虽起源于共同祖细胞，但成年后功能迥异。传统分离方法面临纯度低、耗时长等挑战，特别是难以区分形态相似的ALCs与PTMs，严重制约了男性生殖疾病机制研究和细胞治疗开发。

上海交通大学医学院联合上海科技大学的研究团队在《Reproductive Biology and Endocrinology》发表研究，通过重新分析睾丸单细胞转录组数据，发现整合素α9(ITGA9)和神经生长因子受体(NGFR)的组合表达模式具有细胞特异性。研究人员建立基于这两种标记物的荧光激活细胞分选(FACS)新方案，从梗阻性无精症患者睾丸组织中成功分离出高纯度细胞群体，并实现超过15代的长期培养。

关键技术包括：1）单细胞转录组重分析鉴定标记物；2）免疫荧光验证ITGA9/NGFR在睾丸组织的共定位特征；3）优化酶消化结合流式分选流程；4）建立三维培养体系评估细胞功能。研究队列采用3例经组织学证实具有正常生精功能的梗阻性无精症患者睾丸样本。

表达谱分析揭示标记物特异性
通过分析已发表的单细胞数据，发现NGFR在ALCs和PTMs中均有表达，而ITGA9仅特异性存在于PTMs。免疫共染色证实ITGA9⁺/NGFR⁺细胞与平滑肌肌动蛋白(SMA)共定位，但不表达ALCs标志物HSD3B^β。

新型分选方案实现高效分离
流式分选显示ITGA9⁺/NGFR⁺细胞占0.2%，ITGA9^-/NGFR⁺占0.68%。与传统爬片法相比，新方法将培养周期从4周缩短至1周，且PTMs纯度显著提高（P<0.01）。

长期培养保持功能特性
ITGA9^-/NGFR⁺细胞（ALCs）传代15代后仍保持睾酮分泌能力，其产量随黄体生成素(LH)浓度梯度增加。ITGA9⁺/NGFR⁺细胞（PTMs）则持续表达收缩蛋白CNN1，并能形成管状结构和细胞球体，这种特性在三维培养体系中尤为显著。

功能验证揭示应用潜力
ALCs表达类固醇合成通路关键基因（CYP11A¹、STAR等），而PTMs分泌前列腺素E₂(PGE₂)等炎症因子。特别值得注意的是，PTMs在体外展现类血管内皮细胞的成管能力，为睾丸类器官构建提供了天然支架材料。

该研究首次明确ITGA9/NGFR组合标记在睾丸体细胞分选中的特异性价值，解决了ALCs与PTMs分离的技术瓶颈。突破性发现PTMs的血管生成特性，为生殖组织工程提供了新思路。建立的长期培养体系使大规模获得功能细胞成为可能，不仅有助于解析男性更年期睾酮下降机制，也为生精微环境重建等临床转化研究奠定基础。未来研究可进一步探索这两种细胞在睾丸衰老、不育症等病理过程中的相互作用机制。