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为探究 Oceanusvirus kaneohense 分离株 TetV-1 的感染周期，研究人员利用电镜和转录组学分析其感染绿藻过程。发现潜伏期 16 h、爆发大小～1000，病毒基因表达具时序性，宿主代谢通路改变。该研究为揭示巨型病毒感染机制提供新视角。
在生命科学领域，巨型病毒一直是备受关注的研究对象。核质大 DNA 病毒（NCLDVs）作为一类具有巨大双链 DNA 基因组（可达 2.5 Mbp）和大病毒颗粒（可达 1500 nm）的病毒，其复杂的基因组编码了许多与细胞代谢功能相关的基因，甚至包含大量功能未知的开放阅读框（ORFans）。然而，尽管对部分巨型病毒的基因组进行了测序，但它们的感染周期、基因表达时序以及与宿主的相互作用机制仍存在许多未知。Tetraselmis 病毒 1（TetV-1）作为一种感染绿藻的巨型病毒，其基因组虽已测序，但感染周期的详细信息却知之甚少。为了填补这一研究空白，深入了解巨型病毒的感染机制，夏威夷大学马诺阿分校海洋学系、微生物海洋学研究与教育中心以及菲律宾大学迪利曼分校海洋科学研究所的研究人员开展了相关研究。他们的研究成果发表在《npj Viruses》上，为揭示巨型病毒与宿主的互作机制提供了重要的见解。
研究人员主要采用了以下关键技术方法：一是透射电子显微镜（TEM）技术，用于观察感染过程中宿主细胞的超微结构变化；二是流式细胞术，用于计数病毒颗粒，以确定感染周期中的潜伏期、爆发大小等参数；三是 RNA 测序（RNA-seq）和转录组分析，包括病毒和宿主的转录组组装、差异表达基因分析以及基因本体（GO）富集分析等，以揭示病毒基因的时空表达模式和宿主的响应机制。
研究结果
TetV-1 感染周期和超微结构
通过流式细胞术追踪感染周期发现，感染后前 15.5 小时游离病毒颗粒数量持续较低，16 小时后开始快速增加，17-18 小时达到平台期。根据新产生的病毒数量和感染初期的宿主细胞计数，假设所有细胞均裂解，估计爆发大小约为 800-1000。电镜观察显示，未感染的藻细胞具有完整的细胞器，如细胞核、核仁、叶绿体、线粒体、液泡、蛋白核和眼点等。感染后 15 分钟和 4 小时的细胞与未感染细胞相似，无明显亚细胞结构变化或病毒粒子组装迹象。8 小时的样本中首次观察到细胞内病毒粒子，因此潜伏期（病毒颗粒首次出现的时间）被确定在 4-8 小时之间。此时细胞质的精细结构发生变化，细胞器似乎被压缩到细胞周边，扩展的细胞质区域更呈颗粒状，并出现了假定的病毒工厂（VFs）。病毒工厂是细胞质内的局部区域，中心附近有不完整的衣壳，外围有完整的衣壳。在潜伏期的剩余时间内，病毒工厂一直存在，但到 16 小时时，细胞质中还出现了多个界限分明、染色较深的包涵体（IBs）。此时大多数细胞充满病毒粒子，预示着即将裂解，这从接下来 2 小时内游离病毒的快速增加可以看出。在感染后期的 20 小时，仍观察到一些具有病毒工厂和包涵体的完整细胞，这可能是由于感染起始不同步或潜伏期长度的变化所致。
TetV-1 转录组
先前对 TetV-1 基因组进行测序，使用 Prodigal 预测其包含 663 个基因。当前的 RNA-seq 流程检测到 830 个转录本，其中 167 个（20%）是多外显子转录本。这些转录本中包括 292 个比 Prodigal 预测的基因更长的转录本、27 个与 Prodigal 预测的基因有重叠外显子的转录本、1 个位于内含子内的转录本，以及 10 个外显子与 Prodigal 预测的基因重叠但位于相反链的转录本。感染早期，映射到 TetV-1 的 reads 相对丰度稳步增加，在 8 小时达到峰值，此时约占总 reads 的 58%。随后病毒 reads 的比例下降，推测此时转录减慢，包装和组装等其他过程占主导地位，直到约 16 小时细胞裂解。过滤掉样本间差异较小的转录本后，保留了 94% 的病毒基因（830 个中的 782 个）。前 10 个高表达基因中有 9 个功能未知。通过对所有转录本的基序搜索，发现了一个潜在的 “通用” 启动子基序（ATCCGGA），该基序在所有时间表达组中至少有一部分被观察到，但在即刻早期转录本中最为普遍（92%），而在其他组中（29-39%）较少。针对每个时间簇的基序搜索还发现了其他潜在的启动子，在各组中的流行程度不同：即刻早期（52%）、早期晚期（17%）、晚期（77%）。
在感染早期（15 分钟和 4 小时），检测到病毒转录本的表达。15 分钟时，有 4 个高表达的转录本功能未知。早期表达的基因包括参与碳水化合物代谢的酶，如 α- 半乳糖苷酶（TetV_601）、糖基水解酶（TetV_615）、阿拉伯糖 5 - 磷酸异构酶（TetV_403）和甘露醇 1 - 磷酸脱氢酶（M1DPH，TetV_320）等。此外，假定的宿主免疫抑制基因 vMISTRA（TetV_113）和各种与抑制细胞凋亡相关的含 RING 结构域的蛋白（TetV_277、420、434）以及病毒编码的核糖核酸酶 - 3 基因（TetV_554）也在早期表达。参与转录的基因在早期开始表达，部分基因在整个感染过程中持续表达，如转录起始因子 TFIIIB Brf1（TetV_036）、转录激活因子 SWIB/MDM2（TetV_204）、TATA 盒结合蛋白（TetV_094 和 195）等。参与核苷酸合成和 DNA 复制、ATP 合成及修复的基因也在早期表达。
在感染后期（8-16 小时），与病毒粒子结构和包装相关的基因高度表达，如主要衣壳蛋白（TetV_001）和 VV A32 样病毒粒子包装 ATP 酶（TetV_186）等。一些酶的基因也在后期表达，如糖基转移酶（TetV_241 和 318）、硫酸酯酶（TetV_008 和 050）、脂质分解酶、脂肪酶（TetV_056）和磷酸酶（TetV_413）、蛋白酶（TetV_461 和 556）以及氧化还原酶（TetV_019、191、236 和 626）等。不同的甲基化基因在感染的不同阶段表达，一个含 SET 结构域的蛋白（TetV_181）在早期表达，而四个甲基转移酶在后期表达（TetV_211、484、501、608）。
宿主响应
在进行宿主转录组组装之前，去除了 TetV-1 的 reads，剩余 3.08 亿对末端 reads。通过 Trinity 从头组装得到 159,006 个转录本，对应 69,817 个基因，组装质量较高。为确定宿主对感染的响应，分析了感染早期（15 分钟、4 小时）和晚期（8 小时、12 小时）的差异表达基因。早期差异表达的基因较少，上调的基因集富集了碳水化合物和脂质代谢以及内吞作用相关的 GO 术语，下调的基因集包括与蛋白质修饰 / 运输 / 周转、细胞骨架和叶绿素分解代谢过程相关的 GO 术语。晚期差异表达的基因数量更多，上调的基因涉及免疫和应激反应、核苷酸和脂质代谢、甲基化、RNA 加工和转录、离子运输和蛋白质修饰等 GO 术语，下调的基因集富集了应激 / 防御反应、植物相关形态发生和细胞骨架相关的 GO 术语。此外，宿主中假定的内源性主要衣壳蛋白基因在晚期也上调。
结论与讨论
本研究通过追踪绿藻感染 TetV-1 过程中的转录活性和超微结构变化，揭示了与其他 NCLDVs 及一般病毒感染相似的广泛模式。感染早期表达的病毒基因涉及碳水化合物降解、假定的免疫逃避、转录起始和核苷酸代谢等，而后期表达的病毒基因主要是结构蛋白和 DNA 包装材料。宿主基因的转录变化表明，宿主进行了代谢重编程以适应病毒工厂的产生，并导致宿主代谢和发育的破坏。转录数据扩展和改进了 TetV-1 的基因组注释，同时强调许多高表达的病毒基因功能未知，这些基因是进行功能表征的良好候选，有助于进一步了解巨型病毒如何 commandeer 宿主代谢机制并促进其复制。
该研究不仅为 TetV-1 的感染机制提供了详细的信息，也为巨型病毒与宿主相互作用的研究提供了新的视角和方法。然而，仍有许多问题有待解决，例如病毒工厂和包涵体的具体功能、未知功能基因的作用以及病毒与宿主之间复杂的分子互作机制等。这些未解决的问题为未来的研究提供了方向，有望进一步加深我们对巨型病毒及其在生态和生物医学领域影响的理解。
