mTOR抑制诱导的肿瘤休眠细胞中RT-qPCR内参基因筛选与验证研究

本研究针对mTOR激酶抑制剂诱导的肿瘤休眠细胞中传统内参基因表达不稳定的问题，通过系统评估12个候选内参基因（GAPDH、ACTB等）在AZD8055处理的A549、T98G和PA-1细胞系中的表达稳定性。研究发现核糖体蛋白基因（RPS23/RPS18/RPL13A）和细胞骨架基因ACTB不适用于休眠细胞表达分析，而B2M/YWHAZ（A549）、TUBA1A/GAPDH（T98G）表现最优。该研究为肿瘤休眠机制研究提供了关键标准化工具，解决了mTOR抑制条件下基因表达分析的准确性难题。

　　

在肿瘤治疗领域，mTOR激酶抑制剂的临床应用面临一个棘手问题：虽然这类药物能有效缩小肿瘤体积，却可能诱导癌细胞进入休眠状态，成为治疗抵抗和复发的潜在根源。这种特殊的细胞状态被称为"休眠肿瘤细胞"，其特征是细胞周期停滞在G₁/G₀期，但具体分子机制尚不明确。更令人担忧的是，mTOR作为调控全局翻译的关键激酶，其完全抑制会显著重塑细胞基本功能，导致传统内参基因表达紊乱，这给研究休眠细胞的基因表达谱带来了巨大挑战。

俄罗斯科学院细胞学研究所的Elina R. Iskhakova、Kseniia V. Aleksandrova和Irina I. Suvorova团队在《Scientific Reports》发表的研究，系统评估了12个常用内参基因在mTOR抑制剂AZD8055诱导的休眠肿瘤细胞中的适用性。研究选取了三种不同来源的肿瘤细胞系：肺腺癌A549、胶质母细胞瘤T98G和卵巢畸胎癌PA-1，通过流式细胞术和3D肿瘤球实验验证了AZD8055诱导的休眠模型，采用NormFinder、BestKeeper等四种生物信息学方法分析基因稳定性，最终通过CDK1和CCND1基因表达验证了内参基因选择的准确性。

关键技术方法包括：使用10μM AZD8055处理细胞7天建立休眠模型；流式细胞术结合碘化丙啶染色分析细胞死亡；3D悬滴培养评估肿瘤球形成能力；qPCR检测12个候选内参基因表达；四种统计学算法评估基因稳定性；CDK1/CCND1表达验证内参基因可靠性。

Generation of dormant cancer cells in vitro by pharmacological suppression of mTOR kinase
研究人员使用0.5-10μM浓度梯度的AZD8055处理细胞7天，发现三种细胞系均呈现剂量依赖性增殖恢复。流式检测显示处理组细胞体积显著减小（前向散射值降低），但死亡率与对照组相当。3D肿瘤球实验证实，经AZD8055处理的T98G细胞形成更大肿瘤球，提示休眠细胞可能获得干细胞特性。

Candidate reference gene selection and primer design
精选的12个候选基因涵盖代谢（GAPDH）、细胞骨架（ACTB、TUBA1A）、核糖体蛋白（RPS23、RPS18、RPL13A）等类别。引物效率分析显示，除PGK1（113.5%）、RPL13A（111.9%）和RPS23（114.2%）外，其余引物效率均在90-110%理想范围。

Expression levels and variabilities of candidate reference genes
Ct值分析显示，核糖体蛋白基因（RPS18、RPS23、RPL13A）和ACTB在三种细胞系中变异最大（CV高达8.54%）。A549细胞中YWHAZ（CV=0.71%）、B2M（0.97%）和GAPDH（1.39%）最稳定；T98G细胞中PGK1（2.03%）、TUBA1A（2.04%）和YWHAZ（2.06%）表现最佳。

Expression stability of candidate reference genes
NormFinder和BestKeeper分析一致认定：A549细胞优选B2M和YWHAZ；T98G细胞适合TUBA1A和GAPDH；PA-1细胞中TBP和TUBA1A相关性最低。皮尔逊相关性分析揭示，核糖体蛋白基因与多数基因存在强共表达（|R|>0.7），证实其不适合作为内参。

Validation of expression stability of candidate reference genes
关键验证实验显示：使用不稳定内参基因会导致CDK1表达量被严重低估（如A549细胞中RPS23造成266.2倍差异）。B2M/YWHAZ标准化时，A549细胞的CDK1下调47.5-44.7倍，CCND1下调1.66-1.77倍；TUBA1A/GAPDH标准化时，T98G细胞的CDK1下调34.2-31.2倍，与预期相符。但PA-1细胞未找到合适内参，提示该细胞系休眠机制可能存在特殊性。

这项研究首次系统解决了mTOR抑制条件下肿瘤休眠细胞基因表达分析的标准化难题，揭示了核糖体蛋白基因作为内参的严重局限性。特别值得注意的是，研究发现不同肿瘤细胞系需要特异性内参组合：A549适用B2M/YWHAZ，T98G适合TUBA1A/GAPDH，而胚胎来源的PA-1细胞可能需要寻找新的内参基因。这些发现为后续肿瘤休眠机制研究提供了关键方法学基础，避免因内参选择不当导致的假阳性/假阴性结果。研究还暗示，mTOR完全抑制引发的翻译重编程可能通过核糖体蛋白表达变化影响细胞稳态，这为理解肿瘤细胞休眠的分子机制开辟了新视角。