环状RNA介导的逆向Prime Editing技术突破：Rep-X解旋酶助力人类细胞基因组编辑范围与效率双提升

为解决传统Prime Editor(PE)仅能对切口下游进行编辑的局限性，中国科学院团队开发出基于nCas9-D10A的逆向Prime Editor(iPE)，通过引入环状RNA(ciPE)和Rep-X解旋酶，将编辑效率提升至55.4%，显著拓展了基因组可编辑范围，为遗传病治疗提供了新工具。

　　

基因组编辑领域近年来迎来革命性突破，Prime Editing(PE)技术因其精准编辑能力备受瞩目。然而传统PE系统依赖nCas9-H840A切口酶，仅能对靶DNA链切口下游区域进行编辑，这严重限制了其在基因组中的适用范围。更棘手的是，当研究人员尝试通过替换为nCas9-D10A切口酶开发逆向Prime Editor(iPE)时，编辑效率骤降至不足8.6%，这成为制约技术发展的关键瓶颈。

针对这一挑战，中国科学院的研究团队独辟蹊径，创新性地将环状RNA(circular RNA)与解旋酶技术相结合，开发出环状RNA介导的逆向Prime Editor(ciPE)系统。通过引入大肠杆菌来源的Rep-X 3'→5'解旋酶，团队成功将逆向编辑效率提升至惊人的55.4%，相关成果发表在《Nature Communications》上。

研究采用多项关键技术：1)构建nCas9-D10A为基础的iPE系统；2)设计环状RNA表达载体增强稳定性；3)引入Rep-X解旋酶优化DNA解旋效率；4)建立HEK293T、HeLa等多细胞系验证平台；5)深度测序分析编辑效率与特异性。

【Developing inverse prime editors(iPEs) using nCas9-D10A】
研究首先系统比较了四种iPE变体(iPE2-5)在HBB、HEXA等位点的编辑效率，发现传统iPE效率仅0.04-1.06%。升级为iPEmax后效率提升至8.6%，但仍远低于常规PE。通过GFP报告系统验证，核酸酶依赖型nu-iPE虽提高效率，但伴随大量Indel副产物。

【Circular RNA-mediated inverse prime editors using nCas9-D10A】
创新性引入环状RNA构建的ciPE系统展现出显著优势：在DMD位点编辑效率达7.5%，较传统iPE提升11.8倍。进一步优化的ciPE2-5在PDCD1等位点实现0.1%-24.7%的编辑范围，而核酸酶依赖型nu-ciPE2在PAH位点效率达18.9%。

【Developing helicase Rep-X-assisted ciPEs】
通过整合Rep-X解旋酶，系统性能再获突破：在DMD位点效率提升至16.4%，HEK4位点最高达55.4%。单碱基编辑(16.3%)和大片段编辑(15.1%的6-bp替换)均实现高效完成。跨细胞系验证显示在HeLa、K562等细胞中保持9.1-17.7%的稳定效率。

【Prime editing of disease sites using Rep-X-assisted ciPEs】
在BRCA1(乳腺癌)和RPE65(莱伯先天性黑蒙症)疾病模型位点，Rep-X-ciPE分别实现13.3%和9.5%的编辑效率，显著优于PAMless PE(5.7%/2.9%)和twinPE系统(0.8%/0.5%)。

研究结论指出，Rep-X辅助的ciPE系统通过三重创新：1)nCas9-D10A提高编辑特异性；2)环状RNA增强模板稳定性；3)Rep-X优化DNA解旋效率，成功突破现有PE技术只能编辑切口下游的限制。该技术不仅将逆向编辑范围扩大至切口上游区域，更通过55.4%的高效率为遗传病治疗提供新可能。值得注意的是，系统在BRCA1位点展现96.7%的编辑纯度，且Cas-OFFinder分析显示26个潜在脱靶位点中仅1个出现低于0.67%的脱靶编辑，证实其高安全性。这项研究为基因组编辑领域提供了全新的技术范式，使研究人员首次能够自由编辑基因组中任何位置的致病突变。