质谱驱动的稳定同位素示踪代谢组学揭示细胞内未知代谢反应网络图谱

针对代谢网络图谱不完整的科学难题，中国科学院研究人员开发了IsoNet策略，通过稳定同位素示踪代谢组学技术，在活细胞和小鼠中发现了300余个未知代谢反应，特别是解析了谷胱甘肽代谢网络中3个新型转硫反应，揭示了谷胱甘肽作为硫供体的新功能，填补了代谢网络空白，为探索细胞生化未知领域提供了新工具。

　　

细胞代谢如同精密的交通网络，数以千计的代谢物通过酶促反应相互连接。然而现有代谢数据库如KEGG和REACTOME中，超过30%的基因功能尚未注释，导致代谢网络存在大量空白区域。传统酶活性筛选方法效率低下，而非酶促反应更难以捕捉，这严重限制了人们对细胞生化过程的全面认知。

为突破这一技术瓶颈，中国科学院的研究团队创新性地开发了IsoNet策略。该研究通过整合高分辨率质谱与稳定同位素示踪技术，建立了基于同位素分布相似性的代谢反应预测模型。研究人员向293T细胞和小鼠体内注入[U-¹³C]标记的谷氨酰胺、葡萄糖和乙酸盐等前体物质，利用Orbitrap Exploris 480质谱仪采集代谢物数据，通过MetDNA2平台进行代谢物注释，最终构建包含841个节点、1544条边的同位素相似性网络。

研究首先验证了反应配对代谢物具有相似同位素分布模式的假说。在[U-¹³C]谷氨酰胺标记实验中，174个¹³C标记代谢物形成的199个反应对中，60.7%的配对代谢物同位素相似性评分(S_ISO)大于0.7，显著高于非反应对的18.6%。这种相关性随反应步数增加而减弱，证实了同位素分布相似性可作为反应预测的分子指纹。

通过IsoNet分析，研究团队在谷胱甘肽代谢网络中取得突破性发现。除已知的2个反应外，新识别出8个代谢反应，包括3个首次报道的反应：谷胱甘肽转硫生成γ-Glu-Ser-Gly、乙酰化生成S-乙酰谷胱甘肽、以及氧化生成γ-Glu-3-磺胺酰-Ala-Gly。其中，γ-Glu-Ser-Gly的发现尤为关键——传统认为γ-谷氨酰三肽需通过谷氨酰半胱氨酸合成酶(GCS)和谷胱甘肽合成酶(GSS)的连续催化形成，但同位素示踪实验显示，[U-¹³C]半胱氨酸标记的谷胱甘肽能直接通过转硫反应生成γ-Glu-Ser-Gly，且该产物在小鼠脾脏中含量最高。通过BSO抑制GCS和siRNA干扰实验，证实了γ-Glu-Ser-Gly的生物合成严格依赖谷胱甘肽水平。

研究还利用体外反应体系验证了新发现的代谢反应。例如，谷胱甘肽与乙酰辅酶A非酶促反应生成S-乙酰谷胱甘肽；与Angeli盐反应生成谷胱甘肽亚磺酰胺；与过氧化氢反应依次氧化为谷胱甘肽亚磺酸和谷胱甘肽磺酸。功能代谢组学分析表明，这些新型代谢物能差异调控鞘脂代谢、核苷酸合成和氨基酸代谢等通路，如γ-Glu-Ser-Gly处理显著降低核苷酸水平，暗示其可能通过调节tRNA硫醇化影响翻译过程。

在炎症研究方面，团队在LPS刺激的iBMDM细胞中发现衣康酸相关新型代谢物：衣康酸-半胱氨酸结合物和磺化衣康酸，二者在炎症反应中的水平变化甚至超过衣康酸本身，为解析抗炎机制提供了新线索。

该研究建立的IsoNet策略实现了从"假设驱动"到"数据驱动"的代谢研究范式转变，首次系统性地揭示了细胞内未知代谢反应网络。发现的300余个新反应不仅完善了代谢图谱，更拓展了对谷胱甘肽等多功能分子的认知——除已知的抗氧化作用外，谷胱甘肽还可作为硫供体参与翻译调控。这些发现为代谢性疾病、癌症和炎症等病理过程的机制研究提供了新视角，相关技术框架也可推广至脂质组学等领域。研究成果发表于《Nature Communications》，为探索细胞生化"暗物质"提供了强大工具。