卷曲螺旋结构域介导的TRIM E3蛋白凝聚体调控酶活性与功能特异性的机制研究

这篇研究系统性揭示了TRIM（三结构域）家族蛋白通过卷曲螺旋结构域（CC）形成生物分子凝聚体（condensates）的普遍规律，发现其可动态调控E3泛素连接酶活性，并参与纤毛组装、微管稳定等关键细胞过程。研究通过构建75种人类TRIM蛋白库，结合荧光恢复实验（FRAP）、邻近标记质谱（TurboID-MS）等技术，阐明了CC结构域在相分离中的核心作用，为理解E3泛素化调控和疾病相关突变（如Bardet-Biedl综合征）提供了新视角。

　　

研究背景

TRIM家族蛋白作为E3泛素连接酶，具有RING-B-box-CC（RBCC）的保守结构域和可变C端（CVD），参与抗病毒、细胞发育等过程。尽管部分TRIM蛋白（如PML核体）已知可形成亚细胞结构，但其相分离（phase separation）的普遍性及功能机制尚不明确。本研究通过系统性分析75种人类TRIM蛋白，揭示了CC结构域驱动的凝聚体形成及其对酶活性和细胞功能的调控。

TRIM蛋白普遍形成生物分子凝聚体

通过构建mCherry/mEGFP标记的TRIM蛋白库，在U2OS细胞中发现56/75（75%）的TRIM蛋白可自发形成凝聚体，包括胞质/核内 puncta（如TRIM27）、微管相关纤维结构（如TRIM1）和中心体定位结构（如TRIM43）。荧光漂白恢复（FRAP）实验显示不同TRIM凝聚体动态性差异显著：TRIM38恢复率>50%，而TRIM27几乎无恢复。内源性TRIM38在VSV感染或渗透胁迫下可诱导凝聚，证实其生理相关性。

卷曲螺旋结构域（CC）是凝聚核心驱动因子

结构域缺失实验表明，CC结构域是TRIM38凝聚的必要条件，其单独表达即可形成液滴，而RING或B-box缺失仅部分抑制凝聚。在24种测试的TRIM蛋白中，CC缺失均完全破坏凝聚；其中16种的CC结构域具有独立成滴能力。通过丙氨酸扫描突变发现，CC七肽重复序列（heptad repeats）中疏水残基（a/d位点）的破坏（如L/P突变）会显著削弱TRIM38的自相互作用和凝聚能力。

疾病相关突变破坏凝聚体功能

Bardet-Biedl综合征相关的TRIM32^L163P、癌症相关的TRIM6^L148P等突变均导致凝聚缺陷。值得注意的是，野生型与突变体共表达时，突变体可显性负调控（dominant-negative）正常TRIM凝聚。在急性早幼粒细胞白血病（APL）模型PML-RARα融合蛋白中，CC结构域突变不仅破坏核内凝聚，还影响其招募内源性PML体的能力，提示相分离异常可能是致病机制之一。

凝聚状态双向调控E3酶活性

通过FK2抗体染色和新型BioE3（生物素化泛素标记）系统，发现34/43种TRIM凝聚体富集泛素化信号。对比野生型与L/P突变体发现：

1. 激活型：TRIM38凝聚体促进NAP1泛素化，而L147P突变虽保留NAP1结合能力，却丧失共凝聚与泛素化功能；通过Hotag3-FKBP系统人工诱导凝聚可部分恢复酶活。
2. 抑制型：TRIM1在微管解聚后形成的凝聚体其自泛素化活性降低，提示微管结合可能释放酶活。
   体外重构实验进一步证实，5% Ficoll诱导的TRIM38相分离可增强其自泛素化活性。

凝聚体调控纤毛发生与微管稳定性

TurboID-MS分析21种TRIM互作组发现，17种TRIM（如TRIM6/15/34）通过凝聚体异常富集中心体卫星蛋白（如PCM1），并显著抑制血清饥饿诱导的纤毛形成（ARL13B⁺细胞减少50%）。这种抑制依赖凝聚而非酶活，可能通过隔离关键因子（如CEP131）实现。另一亚群TRIM（1/18/36/46/69）通过COS结构域结合微管，冷处理或nocodazole诱导其从纤维状转为液滴态，同时增强微管稳定性——该功能需CC介导的凝聚与微管结合域协同作用。

TRIM共凝聚的特异性规律

在406对TRIM共表达组合中，仅31%形成共凝聚体（如TR