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为解析非分段负链 RNA 病毒（nsNSVs）聚合酶功能的结构基础，研究人员利用冷冻电镜（cryo-EM）研究尼帕病毒（NiV）L-P 复合物。捕获到其结合 RNA 双链的早期延伸状态，发现 C 端结构域从无序到有序的转变，为理解 nsNSVs 聚合酶机制提供关键 insights。
在病毒的世界里，一群名为非分段负链 RNA 病毒（nsNSVs）的 “杀手” 悄然威胁着人类健康，它们的成员包括麻疹病毒、狂犬病毒和埃博拉病毒等臭名昭著的病原体。其中，尼帕病毒（NiV）作为一种致命的人畜共患病原体，致死率高达 70%，每年在南亚部分地区引发疫情，其引发的呼吸道疾病或脑炎给人类带来了巨大的痛苦和损失。
对于这类病毒，其基因组编码的大型多功能聚合酶（L 蛋白）与磷蛋白（P 蛋白）形成的 L-P 复合物是病毒复制和转录的核心机器。然而，长期以来，人们对 nsNSVs 的 L-P 复合物如何在转录和复制这两种不同功能之间切换以及协调其活动的结构基础知之甚少。尽管已有一些结构研究，但大多数缺乏 RNA 配体，难以将构象与功能状态关联，这使得我们对 nsNSVs 聚合酶功能的分子机制的理解远远落后于分段负链 RNA 病毒。
为了填补这一知识空白，来自瑞典于默奥大学（Ume? University）的研究人员开展了相关研究。他们聚焦于尼帕病毒的 L-P 复合物，利用冷冻电镜（cryo-EM）技术，试图捕捉该复合物在不同功能状态下的结构，以揭示其背后的分子机制。这项研究的成果发表在《TRENDS IN Biochemical Sciences》上。
研究人员主要采用了冷冻电镜（cryo-EM）技术来解析尼帕病毒 L-P 复合物的结构。他们将 L-P 复合物与类似病毒基因组 3' 区域的 RNA 模板（称为前导序列 Le）、ATP、CTP 以及非水解性 GTP 类似物共同孵育，旨在使聚合酶在第一个 GTP 即将掺入产物 RNA 时停滞，从而捕获正在进行 RNA 合成的状态。
尼帕病毒 L-P 复合物 apo 状态与延伸状态的结构解析
通过冷冻电镜，研究人员首先获得了尼帕病毒 L-P 复合物的 apo 状态结构。该结构显示，L 蛋白的 RNA 依赖的 RNA 聚合酶（RdRP）结构域和 GDP 多核糖核苷酸转移酶（PRNTase，负责鸟苷酸加帽）结构域清晰可见，但 PRNTase C 端的结构域由于灵活性较高，没有可解释的密度。
当研究人员将 L-P 复合物与 RNA 模板及核苷酸类似物孵育后，成功捕获到了处于延伸状态的复合物结构。这是首次有研究团队捕获到正在延伸的 nsNSV L 蛋白结构。在该结构中，RdRP 结构域内存在模板 - 产物 RNA 双链，且即将掺入的 GTP 类似物已就位。令人惊讶的是，与 apo 状态相比，PRNTase C 端的结构域发生了显著的有序化，连接器结构域（CD）、甲基转移酶结构域（MTase）和 C 端结构域（CTD）的密度清晰可辨，对应着近 800 个额外可解释的氨基酸结构数据。
构象变化与功能机制的关联
通过对比 apo 状态和延伸状态的结构模型，研究人员发现了引发从头起始和加帽的引发环和侵入环的构象变化。在双链结合状态下，这些环部分有序化并与 CD 结构域接触。此外，RdRp 结构域中被称为支持环和螺旋的区域在 RNA 结合后也变得有序，而在 apo 形式中它们是无序的。这些观察结果表明，特定的有序化模式在早期延伸阶段对稳定灵活的 C 端结构域模块起到了重要作用。研究人员还详细描述了进入的核苷酸和相应的模板核苷酸如何在活性位点被聚合酶残基稳定。
这项研究是迈向详细了解 nsNSVs 多功能复制和转录机器的重要一步。尼帕病毒 L-P 复合物在合成过程中结合 Le 模板和产物 RNA 双链的结构，为我们提供了宝贵的见解。然而，需要注意的是，聚合酶复合物在合成模板基因组 Le 区域的互补链后，才会决定进行基因组复制或 mRNA 转录。因此，Sala 等人捕获的是决定复制或转录之前的状态，要获得 L-P 复合物这些功能特有的结构见解，还需要进一步的研究。例如，新生病毒 mRNA 的帽子是在转录过程中甲基化的，但在双链结合结构中，产物 RNA 到 MTase 结构域没有明确的路径，这表明在决定转录时可能会发生进一步的构象变化。此外，对于已确定的具有可见 CD、MTase 和 CTD 的 nsNSV L 结构，这些结构域相对于 RdRp 和 PRNTase 处于不同的位置，由于这些结构不包括 RNA 配体，它们对应的功能状态的解释变得复杂。未来，为了全面理解结构转变、多种活动以及 L 蛋白与 RNA 的相互作用，有必要捕获带有更多 RNA 配体的聚合酶并分析这些诱导的构象。
总的来说，Sala 等人的研究通过冷冻电镜技术首次捕获到了 nsNSV 聚合酶的延伸状态，揭示了从 apo 状态到延伸状态的构象重塑，特别是 C 端结构域的有序化过程，为深入理解 nsNSVs 聚合酶的功能机制奠定了坚实的结构基础。尽管仍有许多未知等待探索，但这项研究为开发针对 nsNSVs 的抗病毒药物提供了潜在的靶点和理论依据，有望在未来的抗病毒研究中发挥重要作用。
