自沉默腺病毒载体TESSA实现重组腺相关病毒(rAAV)精准感染滴定的创新方法

本文介绍了一种基于自沉默腺病毒平台TESSA的新型rAAV感染测定方法，通过递送AAV复制必需基因和辅助功能，实现在多种细胞类型中精确测定rAAV感染滴度。该方法克服了传统HeLa细胞系TCID50检测的高变异性问题，提高了安全性和重复性，为基因治疗开发和产品放行提供了更可靠的检测工具。

　　

自沉默腺病毒实现重组腺相关病毒精准感染滴定

引言
重组腺相关病毒(rAAV)载体因其安全性高、毒性低、组织嗜性广等特点，已成为基因治疗领域的重要工具。目前已有7种rAAV基因治疗药物获FDA批准，超过300项临床试验正在进行。然而，rAAV感染滴度的精确测定一直是制约其发展的技术瓶颈。

传统TCID₅₀方法的局限性
目前行业标准的rAAV滴度测定方法是基于HeLa细胞系的50%组织培养感染剂量(TCID₅₀)检测。该方法依赖稳定表达AAV2型rep和cap基因的HeLa细胞系，并需要野生型腺病毒(WT Ad)提供辅助功能。然而，这种方法存在三个主要缺陷：1) 检测结果变异性高(变异系数可达60%)；2) 整合基因稳定性问题；3) 使用WT辅助病毒带来的安全隐患。

TESSA平台的创新设计
研究团队开发的"四环素调控自沉默腺病毒"(TESSA)平台通过基因工程改造，在腺病毒主要晚期启动子(MLP)中引入四环素操纵子(TetO)，同时将阻遏蛋白(TetR)置于MLP转录调控下。这种设计形成了一个可被强力霉素调控的负反馈回路，严格控制腺病毒结构基因的表达。TESSA-E1-Rep载体进一步整合了AAV2 rep基因和腺病毒E1基因，可独立于细胞类型提供rAAV基因组复制所需的所有功能。

TREAT检测方法的建立
基于TESSA-E1-Rep载体，研究团队开发了"TESSA Rep-enabled AAV滴定"(TREAT)检测方法。该方法采用两板系统(对照板和测试板)，通过10倍系列稀释rAAV样品并与TESSA-E1-Rep共感染HEK293AD细胞。72小时后，使用TaqMan qPCR检测目的基因(GOI)信号。结果显示：

1. 特异性：对照样品无GOI序列检出
2. 线性：在1.77×10⁵至1.77×10¹ VG/well范围内，R²=0.9997
3. 精密度：6次独立检测结果与平均滴度偏差<±0.35 logTCID₅₀

性能验证与应用
在不同细胞系中的比较研究表明：

• rAAV2在HeLaRC32、HEK293AD和HepG2细胞中感染性最高(颗粒:感染比P:I<100)
• rAAV6感染性次之(P:I比1460-3870)
• rAAV8体外感染效率最低(P:I比1200-8360)

TESSA平台的优势

1. 安全性：自沉默设计避免产生有复制能力的腺病毒
2. 通用性：可在多种腺病毒敏感细胞系中应用
3. 高灵敏度：单次感染事件可产生20,000倍的基因组扩增
4. 符合GMP要求：适用于基因治疗产品的放行检测

展望
TREAT检测方法的建立为rAAV基因治疗产品的开发和质量控制提供了更可靠的工具。未来研究可探索将终点检测方法升级为ddPCR以提高精密度，并评估该方法在预测体内感染性方面的应用价值。