mRNA 5′端帽结构杂质在强制降解条件下的理化与功能评估：揭示翻译效率与免疫原性的关键质量属性

（编辑推荐）本研究通过正交液相色谱-质谱（LC-MS）技术系统评估了Cap-1修饰mRNA在强制降解条件下产生的5′端帽（5′Cap）杂质，揭示了水解和脱嘌呤等多重降解路径。研究发现，IVT（体外转录）缓冲液中MgCl2和亚精胺会加速5′Cap降解，此类杂质显著降低蛋白表达但不触发先天免疫通路（如RIG-I/MDA5），为mRNA治疗药物的关键质量属性（CQA）监控提供了方法论和理论依据。

　　

5′端帽杂质的LC-MS正交分析方法

研究团队开发了两种互补的LC-MS工作流程：RNaseH消化结合生物素化探针富集和RNaseT1消化法。RNaseH法通过RNA/DNA杂交区域特异性切割产生23nt 5′端片段，而RNaseT1在鸟苷（G）位点剪切生成可变长度片段。两种方法均能检测到未加帽杂质（如三磷酸/二磷酸起始变体）和5′Cap降解产物（如m7G水解产物+18Da）。值得注意的是，非模板G插入（由T7 RNA聚合酶偏好引发）和Cap-1水解杂质（占比4.1%）在色谱图中被明确区分。

强制降解揭示5′Cap的化学不稳定性

在模拟IVT条件（pH 8.5、37°C）下，Cap-1萤光素酶（FLuc）mRNA和CleanCap-AG三核苷酸均表现出显著降解。Tris缓冲液中MgCl₂（6 mM）和亚精胺（2 mM）使水解速率提升3倍，主要产物为m7G咪唑环开环（+18Da）和5′-5′三磷酸桥断裂的脱帽pp-AG。EDTA通过螯合Mg²⁺有效抑制降解，证实金属离子在催化中的作用。mRNA在商用IVT缓冲液中72小时即发生近乎完全断裂，凸显生产过程中温度/pH控制的必要性。

杂质对生物学功能的分级影响

通过调控IVT中CleanCap-AG浓度（4 mM至0 mM）和预降解Cap类似物（SL1-SL3），构建了不同杂质水平的FLuc mRNA模型。LC-MS显示，SL3样本中m7G水解杂质占比高达44.3%。体外实验表明：未加帽杂质显著激活IRF/NF-κB通路（p<0.0001），而Cap-1降解仅线性降低蛋白表达（维持2′OMe修饰规避了RIG-I识别）。这一发现明确了5′Cap完整性是影响效价（potency）而非免疫原性的CQA。

分析方法优化的关键洞见

RNaseH消化缓冲液（pH 8.3含Mg²⁺）和IP-RP色谱（75°C）会人为诱导5′Cap降解。实验证明，延长柱温至85°C使水解杂质增加2倍。建议采用参比标准品校正法区分样本固有降解与方法假象，并优化RNaseT1法（pH 7.0无Mg²⁺）以提高准确性。

讨论与行业意义

该研究首次系统阐释了mRNA 5′端帽降解的化学机制及其功能影响，为生产工艺监控（如IVT参数优化、纯化制剂条件）提供了明确指标。正交LC-MS方法的建立填补了复杂杂质分析的空白，而"降解不影响免疫逃逸"的结论为mRNA药物设计提供了新视角。未来需进一步探究不同制剂配方和长期储存对5′Cap稳定性的影响。