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为探究旋毛虫新生幼虫（NBL）感染时 M1 巨噬细胞向 M2 转化的机制，研究人员分析其细胞外囊泡（EVs）中 miRNA let-7-5p 的作用。发现 let-7-5p 靶向 C/EBPδ 抑制 M1 功能，促进 M2 极化，为旋毛虫病防治提供新方向。
旋毛虫（Trichinella spiralis）是一种严重危害人类和动物健康的寄生线虫，其感染引发的旋毛虫病可导致发热、肌痛、器官损伤甚至死亡。在旋毛虫的生活史中，新生幼虫（Newborn Larvae, NBL）阶段是其通过宿主血液扩散至全身的关键时期，此时宿主免疫系统会启动免疫应答，而巨噬细胞作为免疫防御的核心细胞，其极化状态的转变（从促炎的 M1 型向抗炎的 M2 型转化）对宿主与寄生虫的相互作用至关重要。已有研究表明，在旋毛虫感染过程中，巨噬细胞会从 M1 型向 M2 型转变，但其中的具体机制，尤其是 NBL 分泌的细胞外囊泡（Extracellular Vesicles, EVs）及其携带的微小 RNA（microRNA, miRNA）在这一过程中的作用尚不明确。因此，揭示 NBL-EVs 及其关键 miRNA 对巨噬细胞极化的调控机制，对于深入理解旋毛虫的感染机制和开发新的防治策略具有重要意义。
为了回答上述科学问题，中国疾病预防控制中心寄生虫病预防控制所（国家热带病研究中心）的研究人员开展了一系列研究。他们聚焦于 NBL-EVs 中高表达的 miRNA let-7-5p，探究其对 M1 型 RAW264.7 巨噬细胞的免疫调节作用及分子机制。研究发现，let-7-5p 通过靶向转录因子 C/EBPδ（CCAAT / 增强子结合蛋白 δ），抑制 M1 型巨噬细胞的功能，并促进其向 M2 型极化，为旋毛虫感染过程中巨噬细胞极化的调控机制提供了新的见解。该研究成果发表在国际学术期刊《Parasites & Vectors》上。
研究人员主要采用了以下关键技术方法：首先，通过差速超速离心法从旋毛虫 NBL 培养上清中分离提取 NBL-EVs，并利用透射电子显微镜、纳米颗粒跟踪分析和质谱分析对其进行鉴定和表征，确保 EVs 的纯度和可靠性。其次，运用体外共培养实验，将 NBL-EVs 与 RAW264.7 巨噬细胞共培养，并通过 PKH67 荧光标记技术观察 EVs 被巨噬细胞的摄取情况。然后，利用双荧光素酶报告基因实验验证 let-7-5p 与 C/EBPδ 的靶向结合关系。此外，还采用了流式细胞术检测巨噬细胞表面标志物（CD86 和 CD206）的表达，逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）分析相关基因的转录水平，酶联免疫吸附测定（ELISA）检测细胞因子的分泌，以及蛋白质免疫印迹（Western blot）分析 C/EBPδ 蛋白的表达水平等技术手段。
旋毛虫 NBL-EVs 可被 RAW264.7 细胞摄取并抑制其活力
通过 PKH67 荧光标记的 NBL-EVs 与 RAW264.7 细胞共培养实验，利用激光共聚焦显微镜观察到 RAW264.7 细胞能够有效摄取 NBL-EVs，呈现绿色荧光信号，表明 EVs 成功进入巨噬细胞。CCK-8 细胞活力检测结果显示，与 NBL-EVs 共培养 72 小时后，RAW264.7 细胞的密度和存活率显著降低，而转染 let-7-5p 模拟物的细胞活力也明显下降，说明 NBL-EVs 对 RAW264.7 细胞活力的抑制作用主要归因于其携带的 let-7-5p。
let-7-5p 通过靶向 C/EBPδ 抑制 M1 型巨噬细胞表面标志物表达
流式细胞术检测结果表明，M1 型巨噬细胞中 CD86+CD206-细胞比例显著高于 M0 对照组，而 CD86-CD206+细胞比例较低。经 NBL-EVs、let-7-5p 模拟物或 C/EBPδ siRNA 处理后，M1 型巨噬细胞中 CD86+CD206-细胞比例显著下降，CD86-CD206+细胞比例显著上升。当使用 let-7-5p 抑制剂处理时，NBL-EVs 对 CD86 和 CD206 表达的抑制作用部分逆转，表明 let-7-5p 通过靶向 C/EBPδ 抑制 M1 型巨噬细胞表面标志物 CD86 的表达，并促进 M2 型标志物 CD206 的表达。
let-7-5p 抑制 M1 型巨噬细胞的功能活性和炎症因子分泌
一氧化氮（NO）含量检测显示，M1 型巨噬细胞的 NO 生成量显著高于 M0 组，而 NBL-EVs、let-7-5p 模拟物或 C/EBPδ siRNA 处理后，NO 水平显著降低。ELISA 结果表明，M1 型巨噬细胞分泌的促炎细胞因子 TNF-α、IL-1β 和 IL-6 水平显著升高，而经 NBL-EVs、let-7-5p 模拟物或 C/EBPδ siRNA 处理后，这些细胞因子的分泌量显著减少。当加入 let-7-5p 抑制剂后，NBL-EVs 对细胞因子分泌的抑制作用明显减弱，进一步证实 let-7-5p 通过靶向 C/EBPδ 抑制 M1 型巨噬细胞的功能活性和促炎因子分泌。
let-7-5p 调控巨噬细胞极化相关基因的转录水平
RT-PCR 结果显示，M1 型极化后，C/EBPδ、IL-12 和诱导型一氧化氮合酶（iNOS）的 mRNA 水平显著上调，而 let-7-5p、IL-10 和精氨酸酶 - 1（Arg1）的水平下调。经 NBL-EVs、let-7-5p 模拟物或 C/EBPδ siRNA 处理后，C/EBPδ、IL-12 和 iNOS 的转录水平显著降低，let-7-5p、IL-10 和 Arg1 的水平显著升高。let-7-5p 抑制剂处理则导致 IL-12 和 iNOS 转录水平回升，Arg1 转录水平下降，表明 let-7-5p 通过抑制 C/EBPδ 的转录，下调 M1 型标志物基因，上调 M2 型标志物基因，从而调控巨噬细胞极化。
双荧光素酶实验验证 C/EBPδ 为 let-7-5p 的靶基因
双荧光素酶报告基因实验表明，当共转染野生型 C/EBPδ-3′非翻译区（UTR）质粒和 let-7-5p 模拟物时，293T 细胞的荧光素酶活性显著降低，而突变型 C/EBPδ-UTR 质粒与 let-7-5p 模拟物共转染时，荧光素酶活性无明显变化，证实 C/EBPδ 是 let-7-5p 的直接靶基因。Western blot 结果也显示，M1 型巨噬细胞中 C/EBPδ 蛋白表达显著升高，而 NBL-EVs、let-7-5p 模拟物或 C/EBPδ siRNA 处理后，C/EBPδ 蛋白水平显著降低，进一步验证了 let-7-5p 对 C/EBPδ 的抑制作用。
综上所述，该研究揭示了旋毛虫 NBL-EVs 中的 let-7-5p 通过靶向 C/EBPδ，抑制 M1 型 RAW264.7 巨噬细胞的功能活性，促进其向 M2 型极化，从而为旋毛虫感染过程中巨噬细胞极化的调控机制提供了新的分子解释。这一发现不仅加深了对旋毛虫与宿主相互作用机制的理解，也为旋毛虫病的防治提供了潜在的新靶点，例如通过调控 let-7-5p/C/EBPδ 通路来干预巨噬细胞极化，可能成为未来开发抗旋毛虫感染药物或疫苗的重要方向。此外，该研究还为其他寄生虫感染中 EVs 及其携带的 miRNA 在免疫调节中的作用研究提供了参考，拓展了寄生虫 - 宿主相互作用领域的研究思路。
