《Nature Communications》：Sequential structure probing of cotranscriptional RNA folding intermediates
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为解决现有共转录 RNA 结构探测方法无法直接评估中间体结构重排的问题，研究人员开发 Linked-multipoint TECprobe-LM 技术，对大肠杆菌 SRP RNA 等折叠路径进行研究，直接观察到折叠过渡，为解析共转录 RNA 折叠机制提供新策略。
RNA 的折叠过程与其功能密切相关，而共转录折叠作为 RNA 生成过程中的关键环节，一直是生命科学领域的研究热点。传统的共转录 RNA 结构探测方法，如基于静态转录延伸复合体（TEC）的化学探测技术，虽能捕获新生 RNA 的结构，但只能提供终点测量结果，无法直接评估随着核苷酸添加而发生的 RNA 结构重排，难以区分真实折叠中间体与静态复合体中形成的非天然结构。此外，这些方法无法直接观察到一个中间体结构是否能共转录重排为另一个结构，限制了对共转录折叠动态过程的深入理解。因此，开发一种能够直接监测共转录 RNA 结构重排的技术，对于揭示 RNA 折叠的动态机制、解析其功能调控路径至关重要。
为了填补这一研究空白，美国布法罗大学（The University at Buffalo）的研究人员开展了相关研究。他们开发了一种名为 Linked-multipoint Transcription Elongation Complex RNA 结构探测（TECprobe-LM）的新方法，旨在通过化学探测直接评估共转录 RNA 结构的重排过程。该研究成果发表在《Nature Communications》上。
研究人员为开展研究，主要用到以下几个关键技术方法：
- TECprobe-LM 技术：利用光可裂解的 NPOM 笼化 dT 和生物素 - 链霉亲和素路障，将大肠杆菌 RNA 聚合酶（RNAP）依次定位在 DNA 模板的两个或多个位点，对新生 RNA 进行化学探测，从而直接测量 RNA 结构从一个群体到另一个群体的共转录转化。
- 化学探针技术：使用苯甲酰氰（BzCN）等化学探针，对不同转录阶段的新生 RNA 进行结构探测，通过分析核苷酸的反应性变化来推断 RNA 结构的变化。
- 高通量测序与数据分析：对化学探测后的 RNA 进行高通量测序，利用 ShapeMapper2 等软件对测序数据进行处理和分析，计算核苷酸的反应性，构建 RNA 结构模型。
研究结果
共转录 RNA 折叠中间体的序列结构探测策略概述
TECprobe-LM 通过在转录过程中依次将 RNAP 阻滞在特定位置，移除等分试样进行化学探测，直接评估新生 RNA 结构群体是否能通过共转录折叠事件相互关联。该方法与现有静态 TEC 探测方法不同，能够直接检测折叠中间体之间的结构重排，为研究共转录 RNA 折叠动态提供了新视角。
大肠杆菌信号识别颗粒（SRP）RNA 中间体发夹的重排
通过 TECprobe-LM 实验，研究人员将 RNAP 先定位在 + 127 位点（中间体发夹重排前），再追踪至 + 161 位点（预期天然结构形成）。结果显示，在预洗涤和预追踪样本中，观察到 5' 前导发夹、中间体发夹环等结构的反应性特征；转录至 + 161 后，中间体发夹环核苷酸反应性降低，天然 SRP RNA 结构中的柔性核苷酸反应性持续，表明非天然中间体发夹已重折叠为天然结构，且反应性谱与 TECprobe-VL 的终点谱一致。
拜氏梭菌 pfl ZTP 核糖开关适体折叠
在 pfl ZTP 核糖开关适体折叠研究中，RNAP 先定位在 + 102 位点（假结和 P3 亚结构域折叠前），再追踪至 + 120 位点（假结和 P3 折叠后）。发现从 + 102 转录至 + 103 时，ZTP 适体假结开始折叠，且 RNA 出口通道可容纳至少 3 个假结碱基对。进一步通过调整 NTP 浓度和洗涤条件，实现三点 TECprobe-LM 实验，观察到两个连续的折叠事件，揭示了假结折叠与核苷酸添加的紧密关联，以及 ZMP 结合对适体结构的稳定作用。
蜡样芽孢杆菌 crcB 氟化物核糖开关适体折叠
对于 crcB 氟化物核糖开关适体折叠，RNAP 先定位在 + 54 位点（适体折叠前），再追踪至 + 71 位点（假结稳定折叠后）。在无氟化物时，转录至 + 71 导致 U11 反应性增加，提示假结折叠；在有氟化物时，观察到假结稳定、关键碱基对反应性降低等氟化物结合特征，表明氟化物通过稳定假结和关键碱基对来调控适体结构，且 TECprobe-LM 与 TECprobe-VL 数据在适体成熟结构上一致。
氟化物和 ZTP 核糖开关终止子折叠
在终止子折叠研究中，RNAP 分别定位在 + 111（ZTP）和 + 74（crcB）位点，追踪至终止子位点后，观察到终止子发夹折叠的特征性反应性变化，如假结破坏、终止子茎区反应性降低等。氟化物结合可稳定 crcB 适体结构，抑制终止子发夹形成，揭示了配体结合对转录终止的调控作用，且 TECprobe-LM 数据与 TECprobe-VL 结果基本一致，进一步验证了技术的可靠性。
研究结论与讨论
TECprobe-LM 技术通过化学探测直接评估 RNA 折叠中间体的共转录重排，填补了现有方法无法直接观察结构重排的空白。该技术成功应用于大肠杆菌 SRP RNA、ZTP 和氟化物核糖开关等系统，观察到已知的折叠事件，并提供了更高分辨率的结构动态信息，如假结折叠的核苷酸特异性和 RNA 出口通道的容纳能力。
尽管存在依赖 3' 适配器连接效率、NPOM 笼化 dT 位点局限性等技术挑战，但 TECprobe-LM 为研究共转录 RNA 折叠提供了与单分子技术互补的高通量结构信息，有助于解析 RNA 折叠路径和调控机制。其建立的实验框架还可扩展至评估转录速率、配体结合等对折叠动力学的影响，为深入理解 RNA 在基因表达调控中的作用奠定了基础，在生命科学和健康医学领域具有广泛的应用前景，特别是在解析病毒 RNA 折叠、开发新型核糖开关调控药物等方面潜力巨大。
