无活性Cas9抑制DNA末端切除：实现区域限制性随机诱变的新策略

为解决基因复制后序列多样化难题，研究人员利用无活性Cas9(dSpCas9)阻断DNA末端切除，开发出区域限制性随机诱变技术。研究发现dSpCas9可精准抑制酵母中双链断裂(DSB)诱导的末端切除进程，并通过ssDNA特异性qPCR、活细胞成像等技术验证其效率。该成果为基因组工程和进化机制研究提供了新工具，相关研究发表于《iScience》。

　　

基因复制是驱动基因组进化的核心机制，但如何实现复制后基因序列的定向多样化一直是进化生物学和基因组工程的难题。传统方法难以精确控制突变发生的区域范围，而癌症中常见的kataegis（局部超突变）现象提示：双链断裂(DSB)诱导的单链DNA(ssDNA)形成可能成为突破口。然而，如何限制末端切除（end resection） machinery的扩散范围，从而控制突变发生的空间分布，仍是未解之谜。

九州大学医学研究院的研究团队在《iScience》发表的研究中，创新性地利用无活性Cas9(dSpCas9)作为分子路障，成功实现了对DNA末端切除的时空控制。通过将dSpCas9靶向定位在DSB远端，研究人员首次证明这种蛋白质能有效阻断酵母中由Exo1和Dna2介导的末端切除进程，并开发出"可控kataegis"技术，为区域特异性随机诱变提供了新范式。

关键技术方法包括：1) ssDNA特异性qPCR定量末端切除效率；2) Rfa1-mNeonGreen活细胞成像动态监测ssDNA形成；3) Southern blot验证dSpCas9对末端切除的阻滞作用；4) 结合bisulfite处理在CAN1报告基因中评估区域限制性诱变效率。

研究结果
ssDNA特异性qPCR证实dSpCas9介导的末端切除阻断
通过设计SphI酶切位点定量分析发现，当dSpCas9被sg1/sg2引导至DSB远端时，对SphI-3位点的切除阻断效率达71%，显著高于单靶向组（53%）。在rad51△突变体中同样观察到类似模式，证实阻断效应独立于同源重组修复(HR)。

Southern blot杂交揭示dSpCas9的滞留效应
在DSB诱导4小时后，特异性检测到1.3 kb的停滞片段，表明末端切除 machinery被dSpCas9物理阻滞。该信号6小时后减弱，可能与dSpCas9在酵母中约206分钟的驻留时间相关。

活细胞成像显示荧光强度与阻断效率负相关
Rfa1-mNeonGreen标记的ssDNA荧光信号在双靶向组(mNG_Sag1_sg1&sg2)仅为DSB对照组的46%，Pearson相关系数达-0.76，为qPCR结果提供了可视化验证。

bisulfite诱变验证区域限制性突变
在dSpCas9保护的DSB远端，CAN1基因的突变频率降低3倍。高通量测序显示突变以G-to-A为主（占比82%），证实源于end resection而非转录相关的R-loop形成。

结论与意义
该研究首次系统论证了dSpCas9作为可编程分子路障的三大功能特性：1) 方向无关性阻断，不同于其转录抑制的极性效应；2) 多靶点协同增强阻滞效率；3) 与不同CRISPR系统（SaCas9/enAsCas12a）兼容。所开发的"可控kataegis"技术突破了现有定向诱变技术的空间限制，为模拟基因复制-分化进化过程提供了新工具。在应用层面，这项技术可用于：1) 构建基因家族的功能分化突变库；2) 研究DNA修复通路选择机制；3) 开发新型基因组不稳定性模型。未来通过优化dSpCas9变体的DNA结合稳定性，或结合其他ssDNA损伤剂（如APOBEC），有望进一步提升区域诱变的精确性和效率。