澳大利亚温泉宏基因组中发现的热稳定自给型细胞色素P450 CYP116B305的表征及其生物催化应用

本研究针对工业应用中细胞色素P450（CYPs）稳定性差、依赖氧化还原伴侣等瓶颈问题，通过宏基因组挖掘从澳大利亚Innot温泉（71°C）中发现新型热稳定自给型P450酶CYP116B305。该酶在45°C下催化2-羟基苯乙酸（2-HPA）C-5位羟基化的效率显著提升（耦合效率达82%），其血红素域和还原酶域15T50值分别为56.9°C和52.5°C，为高温生物催化提供了新工具。

　　

在生物催化领域，细胞色素P450（CYPs）因其卓越的C-H键氧化能力备受关注，但其工业应用长期受限于热稳定性差、表达效率低以及对氧化还原伴侣的依赖性。传统P450在高温工业环境中易失活，而自给型P450（如CYP102和CYP116家族）虽能通过融合氧化还原域解决伴侣依赖问题，但热稳定性仍是瓶颈。更棘手的是，极端环境微生物难以培养，限制了新型热稳定酶的发现。

为解决这些问题，澳大利亚昆士兰大学等机构的研究团队另辟蹊径，从北昆士兰Innot温泉（71°C）的宏基因组数据中挖掘出新型自给型P450——CYP116B305。该酶源自未培养的Geminicoccaceae家族微生物，其血红素域与还原酶域天然融合，兼具热稳定性和高效电子传递特性。研究发现，CYP116B305在45°C下对2-HPA的羟基化活性较25°C提升6.5倍，耦合效率高达82%，其血红素域15T₅₀达56.9°C，远超常见中温P450（如CYP108A1仅40.1°C）。这项突破性成果发表于《Applied Microbiology and Biotechnology》，为高温生物制造提供了新一代平台酶。

研究团队采用多项关键技术：宏基因组组装与基因挖掘锁定目标序列；大肠杆菌异源表达优化（通过5-氨基乙酰丙酸和核黄素补充提升辅因子装载）；差示光谱法测定热稳定性参数（T₅₀）；紫外-可见光谱分析辅因子结合状态；气相色谱-质谱（GC-MS）鉴定代谢产物；光谱电化学解析氧化还原电位。

关键结果

1. 热稳定性表征：CYP116B305血红素域15T₅₀达56.9±0.1°C，还原酶域为52.5±0.5°C，在45°C下仍保持95%活性，显著优于中温P450。
2. 底物特异性：对2-HPA和HPPA结合亲和力极强（K_D=0.4μM），羟基化位点专一（C-5位），生成高附加值产物高龙胆酸。
3. 温度依赖性催化：45°C时NADPH氧化速率达85 min^-1，较25°C提升6.5倍，耦合效率提高37%。
4. 结构基础：AlphaFold预测显示活性中心保留CYP116家族典型四层残基架构，但存在Ser310/Ile311等独特替换，可能影响热适应性。

结论与意义
该研究首次报道了来自Geminicoccales目微生物的自给型P450，其创新性体现在：

1. 方法论：通过非培养的宏基因组策略突破极端环境微生物酶资源开发瓶颈；
2. 应用价值：高温下增强的催化效率（如2-HPA转化率100%）和稳定性可降低工业过程冷却成本；
3. 机制启示：发现还原酶域可跨分子传递电子，为构建嵌合P450系统提供新思路。

未来研究可聚焦于：优化FMN辅因子装载率（当前仅33%）、解析晶体结构指导理性设计，以及拓展其在芳香族化合物绿色合成中的应用。这项研究为开发"耐高温生物催化剂工具箱"树立了新标杆，对可持续化学生产具有重要推动作用。