水稻免疫受体XA21的菱形蛋白酶OsRBL3b介导切割调控雄性育性与产量的分子机制

这篇研究揭示了水稻免疫受体XA21通过菱形蛋白酶OsRBL3b的时空特异性切割，平衡抗病性与生殖发育的分子机制。OsRBL3b在穗部高表达，通过水解XA21跨膜域（TMD）抑制其过度积累，避免花粉活力下降和花药不开裂导致的雄性不育；而在叶片中低表达的OsRBL3b不影响XA21介导的免疫（PTI/ETI）。该发现为作物抗病-发育协同调控提供了新靶点，并为杂交育种中雄性不育系设计提供理论依据。

　　

Significance
多细胞生物需在抵御病原体入侵的同时保护关键发育过程。水稻免疫受体XA21赋予对白叶枯病菌（Xanthomonas oryzae pv. oryzae）的抗性，而菱形蛋白酶OsRBL3b通过调控穗部XA21稳态水平，避免其激活导致的雄性不育和产量损失。该机制揭示了膜受体蛋白水解在协调免疫与繁殖中的核心作用。

Abstract
生物体需在病原体入侵时保护发育关键组织。研究发现XA21被菱形蛋白酶OsRBL3b在其跨膜域切割，OsRBL3b在穗部特异性高表达。缺失功能性OsRBL3b的XA21水稻表现为花药不开裂、花粉活力下降和产量降低，而叶片中OsRBL3b低表达不影响抗病性。这种通过蛋白酶时空表达平衡免疫与繁殖的策略具有作物改良潜力。

Identification and Cellular Localization of OsRBL3b Protein
通过水稻XA21转基因株系的RNA-seq数据鉴定出OsRBL3b（属RhoA1亚家族），其含7个预测跨膜域，与OsRBL3a同源性最高。GFP标记显示OsRBL3b定位于质膜，与XA21共定位暗示其可能切割XA21。系统发育分析表明OsRBL3a/b分化早于稻属起源。

Preferential Expression of OsRBL3b in Spikelets
微阵列数据显示OsRBL3b在穗部花期高表达，花后迅速下降，而在叶片中表达量极低。RT-qPCR证实XA21低表达株系（Myc-Xa21^L）穗部OsRBL3b转录本丰度是叶片的20倍以上。免疫印迹显示XA21蛋白在穗部积累，且高表达株系（Myc-Xa21^H）含量更高。

OsRBL3b Mediates Cleavage of XA21 in Nicotiana benthamiana
在烟草中共表达Myc-XA21-FLAG与HA-OsRBL3b，发现OsRBL3b依赖性地切割XA21，催化位点Ser187突变（S187A）或改用OsRBL3a均导致切割失效。质谱分析表明切割发生在跨膜域附近。

OsRBL3b Controls XA21 Steady-State Levels in Spikelets
CRISPR/Cas9构建的osrbl3b突变体（osrbl3b-1/2和双等位突变osrbl3b-b）在XA21背景下穗部XA21蛋白积累增加2-3倍，而转录水平不变。叶片中XA21含量不受OsRBL3b缺失影响，印证其组织特异性调控。

OsRBL3b Is Required for Grain Set
osrbl3b-b Myc-Xa21^H完全不育，而osrbl3b Myc-Xa21^L在低温（28/24°C）下结实率降低至30-40%（对照>70%）。夏季高温表型恢复，符合XA21温度敏感特性。接种白叶枯病菌PXO99^A显示osrbl3b突变体保留抗性。

Pollen Viability and Anther Dehiscence Defects
不育株系osrbl3b-b Myc-Xa21^H仅18%花粉可被碘化钾染色（对照>90%），且200个穗部样本均未观察到花药开裂。部分不育株系osrbl3b Myc-Xa21^L约25-28%花药不开裂，花粉活力降至34-38%。

JA Signaling and NLR Activation
RNA-seq分析显示不育穗部66个NLR基因上调，9个JA相关基因（如OsCOI1a、OsJAZs）下调。茉莉酸信号通路抑制可能解释花药发育异常，而NLR激活暗示免疫系统过度激活。

Substrate Specificity of OsRBL3b
XA21跨膜域中Pro652/Pro655突变（P652L/P655L）完全阻断切割。AP报告系统证实OsRBL3b可切割拟南芥BRI1、BAK1等含非经典跨膜域（含脯氨酸/甘氨酸）的RLKs，但不作用于FLS2或LYK5。

Discussion
该研究阐明OsRBL3b通过时空特异性表达平衡XA21介导的免疫与生殖代价。野生稻O. longistaminata可能因无性繁殖耐受XA21的育性代价。茉莉酸信号抑制和NLR激活共同导致不育表型。OsRBL3b对多种RLKs的切割能力暗示其在膜蛋白稳态中的广泛作用，为设计抗病-高产作物提供新思路。

Materials and Methods
实验采用水稻TP309背景，通过农杆菌转化和CRISPR/Cas9编辑构建突变体。蛋白互作通过烟草瞬时表达和HEK293细胞AP报告系统验证。表型分析涵盖花粉活力（I₂-KI染色）、花药开裂率统计及田间接种实验。数据量化采用ImageJ和ANOVA检验。