编辑推荐：
为探究 BRD4 是否及如何调控小胶质细胞功能，研究人员以 EAE（实验性自身免疫性脑脊髓炎，多发性硬化小鼠模型）为对象，构建条件敲除小鼠。发现 BRD4 缺失可减轻神经炎症与脱髓鞘，揭示其在 EAE 进展中对小胶质细胞的关键作用。
在神经炎症性疾病的研究领域，多发性硬化（MS）一直是备受关注的难题。它是一种中枢神经系统（CNS）的神经炎症性疾病，由外周免疫细胞通过受损的血脑屏障（BBB）浸润到中枢神经系统，导致髓鞘广泛脱髓鞘和神经轴突纤维损伤。实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）作为 MS 的动物模型，其发病机制涉及髓鞘特异性 CD4?自身反应性 T 细胞在周围淋巴结被激活，迁移至中枢神经系统并被抗原呈递细胞重新激活。小胶质细胞作为中枢神经系统的常驻先天免疫细胞，在维持中枢神经系统稳态和免疫监视中发挥着重要作用，但在神经炎症情况下会发生形态改变并迁移至炎症部位。然而，小胶质细胞是否能够重新激活迁移到中枢神经系统的 T 细胞，以及 BRD4 在这一过程中扮演的角色尚不清楚。
为了回答这些问题，美国国立卫生研究院（NIH）的研究人员开展了相关研究。他们构建了 CD4? T 细胞和小胶质细胞特异性的 BRD4 条件敲除（Brd4cKO）小鼠，旨在分别研究 BRD4 在周围淋巴结辅助性 T 细胞激活和中枢神经系统小胶质细胞中的作用。研究发现，BRD4 在小胶质细胞中通过调控相关基因的转录，促进神经炎症和脱髓鞘，加剧 EAE 的进展。该研究成果发表在《Journal of Neuroinflammation》上，为深入理解 MS 的发病机制和寻找新的治疗靶点提供了重要依据。
研究人员为开展研究用到了以下几个主要关键的技术方法：
- 构建条件敲除小鼠：将 Brd4?f/f?小鼠与 CD4?Cre?和 Cx3cr1?CreER?小鼠杂交，通过注射他莫昔芬诱导 Cre 介导的重组，实现 BRD4 在 CD4? T 细胞和小胶质细胞中的特异性敲除。
- RNA 测序（RNA-seq）：对小胶质细胞进行分选后，提取 RNA 进行测序分析，以确定 BRD4 缺失对基因表达的影响。
- 流式细胞术：用于分析细胞表面标志物和细胞内细胞因子的表达，检测 T 细胞和小胶质细胞的活化状态和功能。
- 免疫组织化学和组织学分析：通过免疫荧光染色和 Luxol fast blue 染色等方法，观察小胶质细胞和 T 细胞的分布、形态以及脱髓鞘情况。
研究结果
Brd4 表达在 CD4 T 细胞中是初始激活和随后髓鞘特异性效应 T 细胞浸润到中枢神经系统所必需的
通过使用小分子抑制剂的研究表明，BET 蛋白对 T 细胞激活至关重要。为了研究 BRD4 的作用，研究人员构建了 T 细胞中缺乏 Brd4 的 Brd4cKO 小鼠。体外实验显示，来自对照小鼠的 naive T 细胞支持 T 细胞分化，而来自 Brd4cKO 小鼠的 naive T 细胞未能支持体外 T 细胞分化。在 EAE 模型中，对照小鼠在免疫后出现 EAE 症状，而 Brd4cKO 小鼠对 EAE 具有抗性，未出现症状。进一步分析发现，Brd4cKO 小鼠的中枢神经系统中 CD4? T 细胞的浸润显著减少，IL-17A 和 IFN-γ 等细胞因子的表达也降低。这些数据表明，BRD4 在 CD4? T 细胞中促进 T 细胞激活和迁移到中枢神经系统，从而促进 EAE 的发病机制。
Brd4 缺失单独在小胶质细胞中降低小鼠的 EAE 严重程度
为了研究小胶质细胞中 BRD4 对 EAE 病理的影响，研究人员构建了使用 Cx3cr1?CreER?菌株的 Brd4cKO 小鼠。结果显示，Brd4cKO 小鼠的 EAE 临床症状较轻，脊髓白质的脱髓鞘程度明显减轻，小胶质细胞的数量减少且形态更接近稳态的分支状，而对照小鼠的小胶质细胞形态发生改变，呈现出应激状态下的短分支和大细胞体。免疫组织化学和流式细胞术分析表明，Brd4cKO 小鼠的小胶质细胞中 MHCII、CD11c 和 CD80 等分子的表达降低，这些分子与小胶质细胞和 T 细胞的相互作用密切相关。
Brd4 缺失对稳态小胶质细胞的影响
对 naive 小胶质细胞的全基因组转录组分析显示，Brd4cKO 小鼠中有 720 个基因下调，684 个基因上调。基因本体论分析表明，下调的基因涉及单核细胞分化、迁移和白细胞介导的免疫正调控等类别，而稳态相关基因的转录未发生改变。这表明 BRD4 在建立小胶质细胞对外部刺激的反应、细胞迁移和介导免疫方面是必需的。
Brd4cKO 小胶质细胞不表达 EAE 后诱导的基因
对 EAE 小鼠的小胶质细胞进行 RNA-seq 分析，发现 Brd4cKO 小鼠中有 1015 个基因下调，343 个基因上调。下调的基因包括与防御反应、免疫效应过程调节和抗原处理呈递相关的基因，如 MhcII、Cd74、Ccl5、Cxcl9 等。同时，小胶质细胞中与 T 细胞共刺激分子如 CD40、CD80 和 CD86 的表达也下调，这可能导致小胶质细胞与 T 细胞的相互作用减少。此外，Brd4cKO 小鼠的中枢神经系统中 T 细胞的数量明显减少，进一步证实了小胶质细胞中 BRD4 在 T 细胞激活和神经炎症中的作用。
研究结论和讨论
本研究探讨了 BRD4 在 EAE 期间中枢神经系统 Th1/Th17 效应 T 细胞和小胶质细胞中的功能。首先表明，具有 Brd4cKO T 细胞的小鼠不会发生 EAE，这表明 T 细胞中的 BRD4 促进 EAE。研究结果扩展了先前关于 BET 抑制剂逆转 EAE 病理的报道，并阐明了 BRD4 在其他 BET 蛋白中的重要性。
不过，这项研究的核心焦点是探索 BRD4 在 EAE 背景下小胶质细胞中的作用。研究人员首先澄清了小胶质细胞在 EAE 中的作用，因为这个问题一直没有定论。也就是说，小胶质细胞的作用在 MHCII 的背景下一直存在争议，因为结果可能归因于浸润的髓样细胞。研究表明，具有 Brd4cKO 小胶质细胞的小鼠（其外周髓样细胞未改变）不会发展出完全的 EAE，而是表现出脱髓鞘减少、神经炎症减少和瘫痪减少。这些数据提供了令人信服的证据，表明小胶质细胞有助于 EAE 的进展，这与 PLX5622 抑制剂消融小胶质细胞导致 EAE 表型延迟和减轻的报道一致。
此外，研究表明，BRD4 是赋予正常小胶质细胞功能活性的主要因素，并且 BRD4 有助于推动 EAE 的进展。到目前为止，关于 BRD4 在小胶质细胞中的作用的信息很少（如果有的话）。本研究提供了令人信服的证据，表明 BRD4 是小胶质细胞在健康和疾病中的功能和转录组程序所必需的。除了小胶质细胞，BRD4 在各种其他细胞类型的基因表达和功能中也起着关键作用。例如，BRD4 是造血干细胞发育所必需的，并调节外周巨噬细胞的炎症反应。
这项研究中最重要的发现之一是，Brd4cKO 小胶质细胞不会与中枢神经系统中入侵的 T 细胞相互作用。早期报告显示，在 MS 和 EAE 中，小胶质细胞和 T 细胞在病变附近接近，它们通过细胞因子和趋化因子相互作用，损伤程度与携带 MHCII 的小胶质细胞数量和 T 细胞数量相关。使用 PLX5622 抑制剂消融小胶质细胞后，由于脊髓中 T 细胞增殖减少，浸润的 T 细胞数量急剧下降，导致 EAE 发作延迟。通过免疫组织化学和流式细胞术，研究人员在 Brd4cKO 小胶质细胞的中枢神经系统中检测到显著减少的 T 细胞，这可能导致中枢神经系统中 T 细胞与小胶质细胞的相互作用减少。转录组分析提供了 BRD4 在正常和 EAE 条件下控制小胶质细胞功能的机制。Brd4cKO 小胶质细胞不表达 EAE 中载体处理的小胶质细胞表达的 DAM 基因，也不下调稳态基因，这表明 BRD4 提供了特定于 EAE 的转录组程序。已经表明，T 细胞通过小胶质细胞上表达的血管细胞粘附蛋白（VCAM1）浸润脑实质。在 Brd4cKO 小胶质细胞中观察到的侵入性 T 细胞减少到中枢神经系统，至少部分可以通过 Vcam1 表达的下调来解释。
转录组数据显示，Brd4cKO 小胶质细胞中涉及抗原加工和呈递的基因下调，包括趋化因子（如 Cxcl10、Ccl5）、抗原呈递（如 Ciita、Cd74 和 H2-2a）。因此，Brd4cKO 小胶质细胞可能在向传入 T 细胞呈递 MOG 抗原方面存在缺陷，因此无法重新激活它们。此外，在抗原呈递库中的其他基因中，小胶质细胞表达 CD40，这是一种共刺激分子，通过 T 细胞上的 CD40 配体直接与 T 细胞相互作用。据报道，这种相互作用对于 T 细胞扩增和白细胞持续浸润以促进 EAE 疾病进展很重要。由于 CD40 表达在 Brd4cKO 小胶质细胞中减少，这将进一步破坏 T 细胞与小胶质细胞的相互作用，导致 T 细胞扩增的抑制。EAE 的临床症状伴随着中枢神经系统的脱髓鞘，Brd4cKO 小鼠的脱髓鞘减少。值得注意的是，研究人员发现脱髓鞘相关基因（如 Cst7、Ccl6）和再髓鞘相关基因（如 MHC II 和 Cd74）在 Brd4 缺失的小胶质细胞中下调。此外，炎症基因（如 Il1b、Ifit1、Mx1）在 Brd4cKO 小胶质细胞中也下调，这可能导致神经炎症减少。总之，研究数据表明，小胶质细胞中的 BRD4 通过指导共同驱动 EAE 进展的多个基因集来促进 EAE。
综上所述，该研究揭示了 BRD4 在小胶质细胞中通过调控多个基因集，促进小胶质细胞与 T 细胞的相互作用、神经炎症和脱髓鞘，从而加剧 EAE 的分子机制。这些发现不仅为理解 MS 的发病机制提供了新的视角，也为开发针对 BRD4 的治疗策略提供了实验依据，有望为 MS 等神经炎症性疾病的治疗带来新的希望。
