通过多维度筛选开发调控化脓性链球菌麦芽糊精结合蛋白功能的小分子化合物及其抗菌机制研究

为解决抗生素耐药性日益严重的化脓性链球菌（GAS）感染问题，研究人员针对其麦芽糊精结合蛋白SPs0871开展靶向药物开发。通过虚拟筛选结合表面等离子共振（SPR）、差示扫描荧光法（DSF）等生物物理技术，成功鉴定出可竞争性结合SPs0871并抑制GAS生长的先导化合物95,186（KD=44.7 μM），为开发规避耐药性的新型抗菌药物提供了重要依据。

　　

抗生素耐药性已成为全球公共卫生的重大威胁，其中化脓性链球菌（Group A Streptococcus, GAS）作为革兰氏阳性致病菌，可引发从浅表感染到侵袭性症状的多种疾病。尽管抗生素仍是当前主要治疗手段，但过度使用导致耐药菌株激增，加之COVID-19大流行后GAS感染率显著上升，开发新型治疗策略迫在眉睫。传统疫苗研发进展缓慢，而针对细菌毒力因子的干预被认为可减轻选择压力、规避耐药性产生。在这一背景下，GAS的麦芽糊精结合蛋白SPs0871因其在碳水化合物代谢中的关键作用成为潜在靶点——该蛋白通过介导麦芽糊精摄取促进细菌在葡萄糖匮乏环境（如唾液）中的生长，但既往研究发现阻断其配体结合的抗体虽在体外有效，却因无法穿透细菌荚膜而未能抑制体内生长。

为解决这一难题，东京大学等机构的研究团队采用靶向药物开发策略，通过多维度筛选技术成功获得可穿透细菌屏障的小分子抑制剂。研究首先解析了SPs0871的晶体结构（PDB 9KHA），确认其与乳酸乳球菌MalE1蛋白的高度同源性及关键芳香族残基（Y184/W256/W380）构成的配体结合口袋。随后通过虚拟筛选结合两种构象（未结合态与糖结合态）的分子对接，从14万化合物库中初筛1618个候选分子。经差示扫描荧光法（DSF）和表面等离子共振（SPR）二次筛选，发现化合物95,186能特异性结合SPs0871（K_D=44.7 μM）并通过竞争性抑制阻断天然配体麦芽三糖结合。显微尺度热泳动（MST）验证显示该化合物结合依赖于关键残基W256，且对同源蛋白MalE1无交叉反应，体现物种特异性。在含麦芽四糖的限定培养基中，95,186以浓度依赖方式抑制GAS临床分离株（JRS4和SSI-1）生长，且作用为抑菌性而非杀菌性。结构优化发现1,2,4-三唑并[3,4-a]酞嗪骨架对活性至关重要。该成果发表于《Scientific Reports》，为开发靶向膜蛋白的窄谱抗菌药物提供了概念验证。

关键技术包括：1）X射线晶体学解析SPs0871结构（2.20 ?）；2）基于AutoDock Vina的双构象虚拟筛选；3）DSF检测化合物诱导的蛋白热稳定性变化；4）SPR定量分析分子互作亲和力；5）MST验证结合特异性；6）体外生长抑制实验使用临床分离株JRS4和SSI-1。

晶体结构及理化分析
通过2.20 ?分辨率晶体结构揭示SPs0871的开放构象，其配体结合口袋关键残基与乳酸乳球菌MalE1高度保守。SPR测定麦芽三糖结合K_D为0.61 μM，DSF显示配体使蛋白熔解温度（T_m）提升1.2°C，证实筛选体系可行性。

虚拟与生物物理筛选
针对未结合态与同源建模的糖结合态分别筛选，获得229个交叉命中化合物。DSF（ΔT_m>0.4°C）与SPR（响应值≥60）联合鉴定出7个先导分子，其中95,186在两种检测中均表现显著活性。

结合机制验证
MST证实95,186与麦芽三糖竞争结合SPs0871（K_D=44.7 μM），突变分析显示W256是结合热点。分子对接预测该化合物通过氢键（E146/K294）和范德华力（W256）相互作用。

衍生物优化
8种结构修饰显示1,2,4-三唑并[3,4-a]酞嗪核心不可替代，哌啶末端修饰可保持活性（95186b/c的K_D分别为67.1/71.7 μM）。

抗菌活性评估
100 μM 95,186在麦芽四糖培养基中显著抑制GAS生长（OD₆₀₀降低50%），转种THY培养基后细菌恢复生长，证实抑菌作用。

讨论与意义
该研究首次实现针对GAS膜蛋白SPs0871的小分子抑制剂开发，突破传统抗体无法穿透荚膜的限制。虽然化合物亲和力需进一步提升（微摩尔级），但其通过锁定蛋白开放构象阻断功能的新机制，为针对构象变化靶点的药物设计提供范例。研究还揭示碳水化合物代谢通路在GAS感染中的情境依赖性重要性——仅在葡萄糖匮乏时成为致命弱点，这种“条件必需”特性可减少耐药选择压力。未来通过基于复合物结构的理性优化，有望开发出兼具穿透性与高亲和力的临床候选药物，为应对抗生素耐药危机提供新思路。