单分子直接RNA测序技术揭示跨物种表观转录组的塑造机制

为解决传统测序技术在RNA修饰检测中分辨率不足的问题，研究人员开发了深度学习模型SingleMod，实现了单分子水平m6A（N6-甲基腺苷）修饰的精准检测。通过分析8个物种的表观转录组，揭示了m6A分布的三种进化保守模式，并阐明了外显子连接复合体（EJC）介导的修饰抑制机制。该研究为理解RNA修饰的异质性和功能调控提供了新框架，成果发表于《Nature Communications》。

　　

在生命科学领域，RNA修饰如同隐藏在基因表达过程中的密码，其中m⁶A（N6-甲基腺苷）是最常见的信使RNA修饰之一。它像一位神秘的指挥家，调控着基因的表达水平，影响细胞分化、发育甚至疾病发生。然而，科学家们长期以来面临一个技术瓶颈：传统测序方法只能提供RNA修饰的平均信号，无法揭示单个RNA分子上的修饰分布。这种局限性就像试图通过模糊的集体照来辨认每个人的面部特征，难以捕捉到m⁶A修饰在单个RNA分子上的真实面貌及其功能异质性。

为了突破这一限制，中国科学院的研究团队开发了一项创新性技术。他们结合纳米孔直接RNA测序（DRS）和深度学习算法，创建了名为SingleMod的分析工具，首次实现了单分子水平的m⁶A精准检测。这项研究不仅揭示了人类细胞中m⁶A修饰的分子异质性，还通过跨物种比较发现了三种进化保守的m⁶A分布模式，为理解表观转录组的进化规律提供了全新视角。相关成果发表在《Nature Communications》上，标志着RNA修饰研究进入了单分子时代。

研究团队采用了多项关键技术：基于纳米孔平台的直接RNA测序获取全长转录本信息；开发多实例回归（MIR）深度学习框架SingleMod，利用GLORI和eTAM-seq等定量测序数据作为训练基准；整合人类（HEK293T、HeLa）、植物（拟南芥、水稻）和绿藻（莱茵衣藻）等多物种数据提升模型泛化能力；通过分子水平m⁶A定量指标（MPM、MPKM）分析修饰异质性；结合RNA稳定性数据探究m⁶A功能机制。

单分子m⁶A检测模型SingleMod的开发
研究团队创新性地采用多实例回归框架，克服了传统分类模型对完全甲基化位点的依赖。SingleMod直接处理纳米孔原始电信号，通过五层一维卷积神经网络分析每个腺苷位点的修饰概率。在测试中，该模型预测位点甲基化率与GLORI基准的Pearson相关系数达0.965，单分子预测的ROC AUC接近0.95，显著优于现有工具。

单分子分辨率下的m⁶A景观
在人类细胞系中，约50%的mRNA分子完全没有m⁶A修饰，但这些分子主要来自高表达的核糖体蛋白基因。大多数基因（54%）的90%以上RNA分子携带至少一个m⁶A修饰。研究首次提出MPM（每个分子的平均修饰数）和MPKM（每千碱基修饰密度）指标，发现m⁶A数量在基因水平比异构体水平更具异质性。

m⁶A介导的RNA异质性与降解调控
研究发现m⁶A位点虽在转录水平呈现簇状分布，但在单分子上却遵循概率分布。分子异质性分析显示，m⁶A使随机选取两个相同分子的概率降低40%。MPKM与RNA稳定性呈显著负相关（η²=0.14），且这种调控与m⁶A位置无关，呈现累加效应。

跨物种比较揭示三种m⁶A分布模式
通过分析哺乳动物、鱼类、植物、原生生物和藻类等8个物种，发现：1）脊椎动物中EJC介导的"排斥沉积"模式，使m⁶A含量减少75%；2）植物和原生生物中m⁶A集中分布在RNA末端300nt区域；3）绿藻中m⁶A在最后一个外显子均匀分布，但起始500nt区域受抑制。这些模式与系统发育关系高度一致。

这项研究通过单分子测序技术重新定义了表观转录组的复杂性。SingleMod框架的创新性在于突破了传统修饰检测的"群体平均"局限，为研究RNA修饰的分子异质性提供了通用解决方案。跨物种分析不仅验证了EJC在脊椎动物m⁶A沉积中的核心作用，还揭示了其他物种可能存在的"主动招募"机制。这些发现为理解RNA修饰的进化意义和开发基于m⁶A的基因调控工具奠定了理论基础。未来，随着纳米孔测序技术的普及，这种单分子多组学整合的研究范式有望在疾病诊断和RNA治疗领域发挥重要作用。