三角褐指藻培养体系中单克隆抗体易受丝氨酸蛋白酶降解的机制及抑制策略研究

微藻作为生物制剂生产平台面临单克隆抗体(mAbs)产量低的瓶颈。法国鲁昂大学团队通过分析10株三角褐指藻(P. tricornutum)培养体系的蛋白酶活性，发现分泌型丝氨酸蛋白酶是导致mAb降解的关键因素，并证实抑肽酶(aprotinin)可显著提升抗体稳定性，为微藻生物制药工艺优化提供新思路。

　　

在生物医药领域，单克隆抗体(mAbs)作为最重要的治疗性蛋白之一，其市场需求持续增长。传统哺乳动物细胞(如CHO细胞)生产体系虽能实现g L^-1级产量，但存在成本高、工艺复杂等问题。微藻因其生长快速、培养成本低等优势，被视为极具潜力的新型生物制剂生产平台。其中，硅藻纲的三角褐指藻(Phaeodactylum tricornutum)通过核转化可实现抗体的正确N-糖基化，已成功表达具有Fcγ受体结合活性的全长度mAbs。然而，其产量始终徘徊在1-2 mg L^-1，远低于工业需求。

法国鲁昂大学和ALGA BIOLOGICS公司的Carole Burel、Muriel Bardor团队在《Journal of Applied Phycology》发表研究，揭示了制约微藻抗体生产的关键瓶颈。研究人员推测产量受限可能源于分泌效率低或培养体系中蛋白降解，而此前对微藻分泌蛋白酶的研究几乎空白。

研究采用FITC标记酪蛋白蛋白酶活性检测、SDS-PAGE抗体降解分析、抑制剂毒性测试等技术，以10株不同来源的P. tricornutum为研究对象。主要发现包括：

蛋白酶活性特征分析
通过监测Pt1(CCMP 2561)菌株16天培养周期，发现蛋白酶活性与细胞密度呈正相关，且90%以上活性存在于胞外培养基。添加商业化抗体trastuzumab和rituximab后，SDS-PAGE显示24小时内即出现明显降解条带，证实分泌蛋白酶可快速切割抗体分子。

培养条件与菌株差异
调整pH(6-9)、氮源(铵盐/硝酸盐)对蛋白酶活性影响微弱。但10株菌株间存在显著差异：Pt4、Pt5、Pt6、Pt8、Pt9表现出更高活性，部分菌株在培养后期活性骤降，提示蛋白酶分泌具有菌株特异性和时序调控特征。

抑制剂筛选与应用
测试4种抑制剂发现：苯甲脒和Pefabloc SC具有细胞毒性，而抑肽酶和亮肽素对生长无影响。其中抑肽酶(0.1 mM)可使抗体稳定性延长至48小时，且能诱导细胞形成特殊链状结构，暗示蛋白酶可能参与细胞分离过程。

该研究首次系统阐明了P. tricornutum分泌蛋白酶对抗体稳定性的影响，提出抑肽酶保护策略可立即应用于现有生产体系。长远来看，通过活性探针(Activity-Based Protein Profiling)鉴定关键蛋白酶后，采用CRISPR/Cas9基因编辑构建低蛋白酶分泌菌株，将从根本上解决降解问题。这项研究为微藻生物制药工艺开发提供了关键质量控制指标，推动绿色生物制造技术向工业化迈进。