呼吸道合胞病毒RNA依赖性RNA聚合酶新型非核苷抑制剂发现：靶向掌状结构域全新位点的抗病毒机制研究

这篇研究报道了首个靶向呼吸道合胞病毒（RSV）L蛋白掌状结构域的新型非核苷抑制剂（NNI）螺-吲哚酮类化合物的发现。通过冷冻电镜（cryo-EM）解析2.72?分辨率复合物结构，揭示该抑制剂通过诱导构象变化形成全新结合口袋，特异性抑制病毒mRNA转录与复制。该靶点100%保守于RSV A/B亚型，为开发广谱抗RSV药物提供了结构基础。

　　

呼吸道合胞病毒聚合酶抑制剂的突破性发现

设计并表征截短的RSV L+P构建体
为克服全长RSV L+P复合体表达量低的难题，研究团队基于冷冻电镜结构信息，设计了P蛋白N端截短（Δ1-124）的突变体。该截短体不仅显著提高蛋白产量（>50mg），且酶动力学参数与全长蛋白高度一致——对TrC-25 RNA模板的K_M值为0.11±0.02μM，核苷酸底物表观K_M为7.1±1.1μM。值得注意的是，参考化合物对两种构型的IC₅₀相当，验证了截短体在药物筛选中的适用性。

高通量筛选策略优化
研究采用1536孔板格式的焦磷酸发光检测法，通过ATP硫酰酶-荧光素酶级联反应监测RNA合成过程。为避免核苷酸竞争性抑制剂的干扰，实验使用10μM内源性核苷酸（GTP/CTP/UTP）和100μM ATPαS。初筛发现80%假阳性源于ATP硫酰酶抑制，通过建立焦磷酸直接添加的 counterscreen，最终将命中率从3.6%降至0.8%，成功鉴定出先导化合物1（IC₅₀=0.61μM）。

结构-活性关系与先导化合物优化
通过系统修饰螺-氧吲哚核心的R¹（5位卤素/甲基/甲氧基）、R²（N-甲基/环丙甲基）和R³（3-氯吡啶腈/苯基）三个位点，发现22号化合物展现出最佳特性：生化活性IC₅₀=0.27μM（SPR K_D=0.47μM），细胞水平抗病毒EC₅₀=2.38μM（CC₅₀>50μM）。值得注意的是，5-溴取代（化合物1→22）使细胞活性提升3倍，而氰基替换为吗啉（化合物34）则完全丧失活性，提示氰基-赖氨酸相互作用的关键性。

独特的抑制机制解析
酶动力学研究表明，22号化合物对UTP表现为混合型非竞争性/反竞争性抑制（α=0.33±0.27），对RNA模板则为非竞争性抑制（α=1.1±0.6）。Yonetani-Theorell分析证实其与帽结构域抑制剂23（γ=1.1±0.2）和连接子域抑制剂24（γ=0.88±0.72）可同时结合，确证了全新作用位点的存在。单核苷酸掺入实验显示，该化合物能同时抑制从+3位点的de novo起始（pppGA形成IC₅₀=0.29μM）和早期延伸（11-mer产物IC₅₀=0.48μM）。

冷冻电镜揭示结构基础
2.72?分辨率结构显示，22号化合物以L型构象嵌入由motif A/C/D/E形成的诱导口袋中：氰基与Lys885形成氢键，吡啶环与Tyr423发生π-π堆积，溴原子与Asn812构成卤键。与apo状态相比，结合后Phe868、Lys885等残基发生显著构象变化，特别是Gly337的Cα氢与吲哚酮羰基形成伪氢键。值得注意的是，该位点100%保守于RSV A/B亚型，与广谱抗病毒活性数据吻合。

新型α螺旋的稳定化现象
结构分析首次发现，化合物结合可诱导残基655-677区域从无序状态转变为稳定α螺旋。该螺旋虽不直接接触抑制剂，但通过Arg468-Asp794/Glu657盐桥及Asn809-Thr660氢键网络固定，HDX-MS实验证实该区域氘交换率显著降低。与EBOV聚合酶不同，该"支撑螺旋"可能通过稳定病毒启动子初始核苷酸参与调控转录过程。

治疗潜力与转化意义
该研究不仅发现首个靶向RSV聚合酶掌状域的NNI，其作用机制不同于已报道的帽结构域（JNJ-8003）或连接子域（JNJ-7184）抑制剂。与HCV聚合酶抑制剂相比，虽然结合口袋结构相似，但22号化合物表现出独特的非竞争性抑制特征。鉴于目前RSV预防手段（Nirsevimab单抗）仅适用于婴儿，该靶点为开发适用于全人群（特别是疫苗应答不佳者）的小分子疗法提供了新方向。