基于抗N蛋白单克隆抗体的胶体金免疫层析试纸条在猫冠状病毒检测中的应用研究

本研究成功构建了猫传染性腹膜炎病毒（FIPV-DF-2）N蛋白重组质粒pCold I-FIPV-DF-2-N，通过原核表达系统制备了高特异性单克隆抗体mAb 2G7（靶向表位18RGRSNSRGRKN28）和mAb 3H5（靶向表位295GDQVKVTLTHTYYLPKDDAKTSQFLEQID323），并基于双抗体夹心法开发了胶体金免疫层析试纸条。该试纸条对重组蛋白的检测限达209.8 ng/mL，与PCR检测的临床腹水样本符合率为70%，且与猫细小病毒（FPV）、猫杯状病毒（FCV）和猫疱疹病毒（FHV）无交叉反应，为猫冠状病毒（FCoV）的现场快速检测提供了简便工具。

　　

ABSTRACT

猫冠状病毒（FCoV）包含猫肠道冠状病毒（FECV）和猫传染性腹膜炎病毒（FIPV），前者引发自限性胃肠炎，后者则导致高致死率的免疫介导疾病。研究表明，FIP的发生与FECV感染期间的病毒基因组突变相关，因此早期诊断FECV对预防FIP至关重要。本研究通过构建FIPV-DF-2病毒N蛋白的重组质粒pCold I-FIPV-DF-2-N，经原核表达和纯化后免疫BALB/c小鼠，成功制备了靶向N蛋白不同表位的单克隆抗体mAb 2G7和mAb 3H5。通过免疫荧光（IFA）和Western blot验证，二者特异性识别FIPV-DF-2，且与FPV、FCV、FHV无交叉反应。表位定位显示，mAb 2G7结合N蛋白18-28位氨基酸，mAb 3H5结合295-323位氨基酸，保守性分析表明二者表位在45株FCoV中同源性分别达97.78%和98.62%。

MATERIALS AND METHODS

实验采用FIPV-DF-2（GenBank: JQ408981.1）等病毒株，通过原核系统表达N蛋白并纯化。免疫小鼠后，通过细胞融合和HAT培养基筛选获得杂交瘤细胞，最终制备单克隆抗体。胶体金试纸条以mAb 3H5标记金纳米颗粒，mAb 2G7包被检测线，采用双抗体夹心法设计。灵敏度测试显示对重组蛋白的检测限为209.8 ng/mL，临床样本检测与PCR结果一致性为70%。

RESULTS

1. 蛋白表达与抗体制备：SDS-PAGE和Western blot证实N蛋白分子量为45.6 kDa（图1）。IFA显示小鼠血清效价达1:1,280（图2），mAb 2G7和mAb 3H5仅与FIPV-DF-2反应（图3）。
2. 表位鉴定：截短表达和IFA确定mAb 2G7和mAb 3H5的最小表位分别为18RGRSNSRGRKN28和295GDQVKVTLTHTYYLPKDDAKTSQFLEQID323（图4-5）。
3. 试纸条性能：试纸条对FPV、FCV、FHV无交叉反应（图7c），临床腹水样本检测阳性率70%（图7d）。

DISCUSSION

N蛋白因其高保守性和丰富表达成为理想检测靶点。本研究开发的试纸条操作简便（15分钟出结果），但灵敏度需优化，可能与裂解缓冲液对N蛋白抗原性的影响有关。未来可通过改进释放剂提升性能，弥补PCR设备依赖性强的问题。

CONCLUSION

基于双抗体夹心法的胶体金试纸条为FCoV筛查提供了高效工具，有助于降低FIP发病率。

ACKNOWLEDGMENTS

研究受国家自然科学基金（32370164）和中央级公益性科研院所基本科研业务费（1610302022009）资助。