肝星状细胞与库普弗细胞通过细胞外囊泡介导的TLR4依赖性双向互促激活机制在肝纤维化中的作用

本研究针对肝纤维化中细胞间通讯机制不明的问题，通过建立共培养模型探究了肝星状细胞（HSCs）与库普弗细胞（KCs）通过细胞外囊泡（EVs）和TLR4通路介导的双向激活机制。研究发现：1）共培养体系中HSCs与KCs通过分泌因子（含EVs）相互激活，促炎刺激（LPS）通过TLR4依赖性方式放大该效应；2）KC来源EVs可部分激活HSCs的αSMA和胶原蛋白表达；3）TLR4抑制剂TAK-242能阻断炎症级联反应。该研究为肝纤维化治疗提供了EVs-TLR4轴的新靶点。

　　

肝纤维化是全球范围内导致肝硬化和肝癌的主要病理过程，其核心特征是肝星状细胞（HSCs）异常活化及细胞外基质（ECM）过度沉积。尽管已知库普弗细胞（KCs）作为肝脏驻留巨噬细胞在HSCs激活中起关键作用，但二者间的双向通讯机制尤其是细胞外囊泡（EVs）的作用尚未阐明。临床上，代谢相关脂肪性肝病（MASLD）等慢性肝病患者常伴随肠道菌群紊乱导致的脂多糖（LPS）入血，通过Toll样受体4（TLR4）持续激活KCs，加速纤维化进程。然而，这种炎症环境下HSCs与KCs如何通过EVs相互影响，成为阻碍纤维化治疗突破的关键科学问题。

针对这一空白，中国的研究团队在《Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Molecular Basis of Disease》发表的研究中，通过建立大鼠原代HSCs与KCs的Transwell共培养系统，结合EVs分离、TLR4抑制剂干预和实时细胞分析等技术，揭示了EVs-TLR4轴介导的双向激活机制。

关键技术方法
研究采用雄性Wistar大鼠分离原代HSCs和KCs，通过差速离心法从KC条件培养基中提取EVs，经纳米颗粒追踪分析（NTA）和CD63/TSG101标志物验证。建立Transwell共培养系统评估细胞互作，使用LPS（50 ng/mL）和TLR4抑制剂TAK-242（5 μmol/L）处理，通过qPCR、Western blot和免疫荧光检测αSMA、Col1a1等纤维化标志物及IL-1β、TNF-α等炎症因子。

研究结果

3.1. Kupffer细胞体外表征
原代KCs呈现特征性"煎蛋"形态，CD163阳性率>95%。随培养时间延长，促炎因子Il1b、Il6表达下降，提示体外培养可自发缓解炎症状态。

3.2. Kupffer细胞来源EVs的特征
EVs直径约170 nm，含CD63和TSG101标志物但无线粒体污染。LPS处理使EVs浓度降低且粒径分布更异质。

3.3. 共培养系统中的双向调控
HSCs与KCs共培养24小时即导致：1）HSCs中αSMA和I型胶原蛋白表达增加2.3-2.4倍；2）KCs中Il1b、Tnfα等炎症基因上调1.9-3.3倍，证实二者存在正反馈激活。

3.4. KC-EVs对HSCs的激活作用
KC来源EVs（1 μg/mL）虽未改变Acta2等基因表达，但使HSCs的αSMA蛋白水平短暂升高（24小时达峰），并促进细胞增殖。

3.5. LPS的协同效应
LPS预处理使共培养系统中：1）HSCs的αSMA和胶原蛋白表达进一步增加至2.8-2.9倍；2）炎症基因Il1b表达暴增55.8倍，显示炎症环境显著放大互促效应。

3.6. TLR4抑制的阻断作用
TAK-242可抑制共培养系统中KC的炎症反应（Il1b降低2.4倍），但对HSCs的纤维化标志物无直接影响，表明TLR4主要调控炎症环节。

3.7. LPS-EVs的特异性激活
LPS刺激的KC-EVs（EVs_KC_LPS）较普通EVs更能诱导HSCs中Il1b等炎症基因表达，并使αSMA蛋白水平额外增加7%，证实EVs cargo受KC激活状态调控。

结论与意义
该研究首次系统阐明：1）HSCs与KCs通过EVs和可溶性因子形成TLR4依赖性双向激活环路；2）LPS通过改变EVs cargo增强促纤维化效应；3）靶向TLR4-EVs轴可同时干预炎症和纤维化。这一发现为肝纤维化治疗提供了新思路——通过调节KC活化状态（如TLR4阻断）改变EVs分泌谱，而非单纯抑制HSCs活化。未来需进一步解析EVs中特异性miRNA或蛋白组分，推动基于细胞间通讯的精准治疗策略。