基于硫醇-马来酰亚胺化学的VHH抗体片段与多糖高效位点特异性偶联技术研究

研究人员针对蛋白质治疗药物半衰期短、传统PEG化技术存在非生物降解性问题，开发了基于硫醇-马来酰亚胺化学的VHH抗体片段（单链重链抗体可变区）与多糖（葡聚糖/透明质酸）位点特异性偶联技术。通过基因工程在VHH C端引入游离半胱氨酸（Cys），结合柔性G4S连接子优化，使偶联效率从<20%提升至>90%，同时保持纳摩尔级靶标结合力（KD），为延长纳米抗体药效提供新策略。

　　

在生物医药领域，蛋白质药物因其高特异性和低毒性已成为肿瘤、自身免疫疾病治疗的重要武器。然而这些"生物导弹"面临一个致命短板——分子量低于肾脏过滤阈值（约45 kDa）的蛋白质会被快速清除，例如单链重链抗体可变区（VHH）的半衰期仅约2小时。传统解决方案是将蛋白质与聚乙二醇（PEG）偶联以增大分子量，但PEG的不可降解性可能引发蓄积毒性。为此，科学家们将目光转向可生物降解的多糖材料，但随机偶联可能破坏蛋白质活性位点，如何实现精确可控的偶联成为关键挑战。

针对这一难题，来自荷兰的研究团队在《Bioconjugate Chemistry》发表创新成果。他们选择两种天然多糖——葡聚糖（Dex）和透明质酸（HA），通过化学修饰在其骨架上引入马来酰亚胺（Mal）活性基团。同时选取6种靶向不同疾病靶点（如TNFα、IL-1R等）的VHH抗体片段，通过基因工程技术在C端延伸序列中植入游离半胱氨酸（Cys）。当这两种组分相遇时，Cys的巯基会与Mal发生特异性点击化学反应，形成稳定的硫醚键连接。

研究采用核磁共振（¹H NMR）确认多糖修饰程度，通过SDS-PAGE和Western Blot定量偶联效率，并利用表面等离子共振成像（SPRi）技术测定结合动力学参数。特别针对偶联效率低（<20%）的抗TNFα-VHH，团队设计了两套优化方案：一是插入柔性G₄S连接子（GGGGSGGGGS）增加Cys可及性；二是在C端串联两个Cys标签。实验所用VHH通过酿酒酵母表达系统生产，并经Capture-Select亲和层析纯化。

3.1 多糖-马来酰亚胺合成
研究团队开发了四步法合成Dex-Mal：先通过对硝基苯氯甲酸酯（PNC）激活葡聚糖羟基，再与Boc保护的二胺反应，脱保护后最终与AMAS试剂偶联获得目标产物，¹H NMR显示每100个单糖单元修饰6个Mal基团。HA-Mal则通过DMTMM介导的羧基活化，与氨基乙基马来酰胺反应，获得每100个二糖单元含12个Mal的产物。

3.2 VHH偶联效率差异
六种Cys标签VHH与多糖的偶联效率呈现显著差异：抗HIV-VHH1/2和抗IL1R-VHH效率>70%，而抗TNFα-VHH仅5-7%。SPRi检测显示这种差异并非源于靶标结合力变化（所有VHH的K_D均<1 nM），而是与Cys的空间可及性密切相关。

3.3 G₄S连接子的妙用
在抗TNFα-VHH的抗原结合区与Cys标签之间插入(G₄S)₂连接子后，偶联效率飙升至75%。有趣的是，虽然连接子使结合速率（k_on）略有下降，但解离速率（k_off）同步降低，最终K_D仍保持216 pM的高亲和力。

3.4 双Cys标签的协同效应
进一步在C端引入第二个Cys标签的VHH变体，其与HA-Mal/Dex-Mal的偶联效率突破90%。SPRi分析显示，形成的VHH-多糖复合物虽呈现略低的k_on（2.31×10⁵ M^-1s^-1 vs 游离VHH的3.25×10⁵），但得益于多价效应，实际应用中可能增强靶标捕获能力。

这项研究建立了VHH-多糖生物偶联的标准化方案，其创新性体现在三方面：首先，选用可降解多糖替代PEG，符合绿色制药趋势；其次，通过理性设计G₄S连接子和多Cys标签，解决了空间位阻导致的偶联效率低下问题；最后，SPRi技术证实偶联产物仍保持纳摩尔级结合力。该技术不仅可延长VHH半衰期，其构建的多价复合物还可能增强药物效能，为纳米抗体药物的临床转化提供新工具。未来研究可探索更高分子量多糖载体，以进一步提升药物的"隐形"效果和治疗指数。