人源肝脏类器官CYP酶活性评估：基于LC-MS/MS的鸡尾酒法开发与验证

为解决肝脏类器官中关键细胞色素P450酶(CYPs)活性同步检测的技术空白，南方医科大学团队开发了基于LC-MS/MS的鸡尾酒法，可同步评估CYP1A2/3A4/2C9/2C19/2D6五种主要亚型的代谢活性。该方法通过六分钟单次进样完成多代谢物检测，经FDA标准验证，证实其在高通量药物代谢评价中的应用潜力，为类器官模型的功能标准化提供新工具。

　　

肝脏作为人体最重要的代谢器官，其核心功能依赖于细胞色素P450酶(CYPs)家族对药物和毒素的生物转化。然而，传统研究模型存在显著局限：动物模型因种属差异难以模拟人类代谢特征，原代肝细胞(PHHs)虽接近生理状态，却面临来源稀缺、培养易去分化等问题。肝脏类器官技术的出现为这一领域带来曙光，这种由成体干细胞自组装形成的三维微器官能长期维持肝脏特征，但其代谢功能的系统评估仍缺乏标准化方法——尤其是涉及90%临床药物代谢的CYP1A2、3A4、2C9、2C19和2D6等关键亚型活性检测，现有技术仅支持单酶检测，效率低下。

针对这一技术瓶颈，南方医科大学团队在《Drug Metabolism and Disposition》发表研究，建立了基于液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)的鸡尾酒法。研究人员从肝癌患者的癌旁组织分离培养肝脏类器官，通过优化五种CYP特征底物（酚酞、睾酮、双氯芬酸、右美沙芬和奥美拉唑）的共孵育条件，开发出能在6分钟内同步检测所有代谢产物的MRM（多反应监测）分析方法，并严格遵循FDA生物分析方法验证指南进行系统验证。

主要技术路线
研究首先从肝癌手术标本获取非肿瘤组织建立类器官培养体系，经组织学和标志物验证其肝脏特征；随后通过动力学实验确定各CYP底物的最佳孵育浓度，建立LC-MS/MS的ESI正离子模式检测方法；最终通过单独vs混合底物实验及酮康唑抑制实验验证方法可靠性。

Establishment and Verification of Human Liver Organoids
从10例肝癌患者的癌旁组织成功构建类器官，分化后呈现典型管腔结构并表达ALB⁺/CK19⁺等肝系标志物，证实其具备肝实质细胞和胆管细胞双重特性。

Development and Validation of the LC-MS/MS Method
建立的MRM方法对5种代谢物（对乙酰氨基酚、4-羟基双氯芬酸、右啡烷、6β-羟基睾酮和5-羟基奥美拉唑）的检测限达0.1-5 ng/mL，日内日间精密度RSD<15%，回收率85%-115%，完全符合FDA标准。关键突破在于通过梯度洗脱程序实现所有分析物在6分钟内基线分离。

Kinetic Studies and Cocktail Assay Validation
动力学实验显示各底物在类器官中的代谢符合米氏方程，V_max值与原代肝细胞文献值相当。混合孵育实验证实底物间无显著相互作用——代谢产物浓度与单独孵育差异<10%，且CYP3A4特异性抑制剂酮康唑仅选择性抑制6β-OH-TST生成。

讨论与意义
该研究首次在肝脏类器官中实现多CYP活性的同步定量，其创新性体现在三方面：技术层面，将传统单酶检测的48小时流程压缩至单次6分钟分析；应用层面，为类器官的药物代谢表型鉴定提供标准化工具；科学层面，证实类器官能稳定维持CYP酶的功能耦合性。这种方法特别适用于个性化医疗中的药物代谢谱分析，例如预测患者对CYP2C19底物（如氯吡格雷）的代谢差异。未来通过整合更多CYP亚型（如2B6、2E1），可进一步扩展该技术在药物相互作用研究中的应用广度。

值得注意的是，研究团队在方法学设计中刻意保留DMSO作为溶剂（终浓度<0.1%），既保证疏水性底物溶解，又避免有机溶剂对酶活的干扰，这一细节处理凸显实验设计的严谨性。该成果为类器官在药物开发领域的标准化应用树立了新标杆。