高通量测序揭示制药用水系统中细菌群落结构及优势菌种的动态变化

为解决制药用水微生物质量控制中传统培养方法耗时长、存在培养偏差的问题，研究人员采用Oxford Nanopore MinION平台对制药水系统进行高通量测序，揭示了不同处理阶段（城市水、反渗透水、超滤水）中Phreatobacter、Methylobacterium和Ralstonia等优势菌种的动态变化，证明该技术可快速识别不可培养菌群，为制药行业微生物风险监控提供新范式。

　　

在制药行业中，水的微生物质量直接关系到药品安全性。传统依赖培养的检测方法需数天时间，且无法识别高达99%的不可培养细菌，这给质量控制带来巨大隐患。随着各国药典逐步引入快速微生物检测方法，如何实现高效、全面的微生物监控成为行业焦点。

为解决这一难题，来自国内某制药研究中心的研究团队创新性地将Oxford Nanopore Technologies的MinION便携式测序仪应用于制药用水系统监测。他们通过对城市原水(SP-CW)、反渗透处理水(SP-RO)和超滤处理水(SP-UF)三个关键节点的滞留水样本进行分析，首次系统揭示了制药用水系统中细菌群落的动态演替规律。相关成果发表在《European Journal of Pharmaceutical Sciences》上，为制药行业微生物风险管理提供了全新解决方案。

研究采用多技术联用策略：通过SYBR Green I和6-CFDA染色进行总菌计数；qPCR定量16S rRNA基因拷贝数；分别使用MinION和Flongle流动池进行全长16S rRNA基因测序；结合MALDI-TOF-MS(基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱)和传统培养法验证。所有样本均来自日本东部某制药研究中心的供水系统，在2022年11月至2023年6月间分四次采集滞留水样本。

3.1 细菌丰度
研究发现城市水(SP-CW)中细菌浓度最高（1.7-6.5×10³ cells/ml），经反渗透(RO)处理后显著降低。超滤(UF)处理后在非清洁期仍检出细菌，但系统加热消毒后未检出，证实热消毒对Ralstonia pickettii的有效性。

3.2 MinION测序揭示细菌群落结构
通过两种流动池测序均发现：城市水中Phreatobacter cathodiphilus稳定占优（17%-26%）；RO处理水中Methylobacterium fujisawaense占据绝对优势（>95%）；UF处理水中Ralstonia pickettii占比超93%。该结果与培养分离结果高度一致，验证了测序可靠性。

3.3 分离菌株鉴定
从R2A培养基随机挑选的菌落中，44/48个RO样本菌落经MALDI-TOF-MS鉴定为M. fujisawaense；所有UF样本菌落均为R. pickettii，与测序结果相互印证。

讨论部分指出，该研究首次系统描绘了制药用水系统中细菌群落的阶梯式变化：城市水中的Phreatobacter、RO阶段的Methylobacterium和UF阶段的Ralstonia构成特征性"指示菌群"。其中R. pickettii被证实可通过系统加热有效清除，这为制定消毒策略提供了依据。研究特别强调，相比传统培养法，MinION测序能在6小时内完成从样本到结果的全流程，且成本更低的Flongle流动池即可满足常规监测需求。

该研究的突破性在于：①建立制药用水系统的微生物特征图谱，为异常监测提供基线；②验证纳米孔测序在GMP(药品生产质量管理规范)环境下的适用性；③发现RO处理对Methylobacterium的选择性富集现象。这些发现不仅符合欧洲药典(Ph. Eur.)和日本药典(JP)对快速微生物方法(RMM)的倡导，更推动制药质量控制从"被动响应"向"主动预警"转变。随着测序数据库的完善和标准化，该方法有望成为制药用水微生物监控的新标准。