重组BCG携带BFNA融合基因对EB病毒阳性肿瘤的抑制作用及其免疫机制研究

本研究针对EB病毒(EBV)相关肿瘤缺乏有效疫苗的难题，开发了携带BZLF1-EBNA1(BFNA)融合基因的重组卡介苗(rBCG)。实验证实该疫苗能显著延迟EBV阳性肿瘤(NPRC18细胞)生长，促进CD4+/CD8+ T细胞浸润，增强细胞毒性T淋巴细胞(CTL)活性，为EBV相关肿瘤免疫治疗提供新策略。

　　

EB病毒(EBV)作为I类致癌物，与鼻咽癌、淋巴瘤等多种恶性肿瘤密切相关。尽管该病毒发现已近60年，但由于其复杂的潜伏-裂解周期转换机制，至今仍未出现成熟的预防性疫苗。更棘手的是，在EBV阳性肿瘤细胞中，病毒通常处于潜伏期，其基因组整合至宿主细胞后逃避免疫监视，导致传统治疗手段效果有限。如何通过免疫手段同时靶向潜伏期病毒和激活特异性抗肿瘤免疫反应，成为当前研究的重大挑战。

济宁医学院基础医学院的研究团队创新性地将病毒裂解周期关键调控因子BZLF1与潜伏期必需蛋白EBNA1构建为融合基因BFNA，并利用重组卡介苗(rBCG)作为载体进行递送。这种"双管齐下"的策略既能通过BZLF1诱导病毒进入裂解周期直接杀伤肿瘤细胞，又能通过EBNA1激发特异性免疫应答。相关成果发表在《Applied Microbiology and Biotechnology》期刊，为EBV相关肿瘤的免疫治疗提供了新思路。

研究采用分子克隆技术构建pMV261-BFNA重组质粒，通过电转化导入BCG；采用Western blot验证融合蛋白表达；通过ELISA和ELISPOT检测体液与细胞免疫应答；建立C57BL/6J小鼠NPRC18肿瘤模型评估预防和治疗效果；采用流式细胞术分析CD4⁺/CD8⁺ T细胞亚群变化。

融合基因构建与验证
通过重叠PCR成功构建1500bp的BFNA融合基因，Western blot证实55.5kDa融合蛋白表达。酶切鉴定显示重组质粒包含预期的4.5kb载体片段和1.5kb插入片段，测序结果与NCBI数据库完全匹配。

免疫应答分析
ELISA显示rBCG免疫组血清抗BZLF1/EBNA1抗体效价显著升高（最高1:13600）。ELISPOT检测发现rBCG组脾细胞分泌IFN-γ斑点数达15.09±2.87/4×10⁵细胞，显著高于单基因疫苗组（P≤0.01）。

肿瘤抑制效果
预防实验中rBCG使肿瘤发生时间延迟至22.03±1.09天（对照组7.84天），肿瘤体积和重量分别降低74.8%和80.6%。治疗实验中，rBCG组肿瘤体积缩小95.2%，显著优于BCG-EBNA1（12.6%）和BCG-BZLF1（28.8%）单基因疫苗。

免疫机制解析
流式显示rBCG组CD4⁺和CD8⁺ T细胞比例显著增加（P<0.01）。组织病理学显示rBCG组肿瘤组织存在大量淋巴细胞浸润和坏死区域，而对照组仅见稀疏免疫细胞。

该研究首次证实BFNA融合基因可协同增强rBCG的抗肿瘤效果：EBNA1通过MHC I/II途径激活CD4⁺/CD8⁺ T细胞应答，BZLF1则诱导潜伏EBV进入裂解周期直接杀伤肿瘤细胞。这种"免疫激活-病毒裂解"双效机制为EBV相关肿瘤提供了新型治疗策略。特别值得注意的是，rBCG作为活疫苗能在体内持续表达抗原，且BCG本身具有强免疫佐剂效应，这使得该疫苗相比传统亚单位疫苗具有显著优势。研究为开发EBV治疗性疫苗奠定了重要基础，其融合基因设计思路也可拓展至其他病毒相关肿瘤的免疫治疗领域。