靶向A4GALT的siRNA脂质纳米颗粒改善法布里病表型：内皮细胞疗效优于足细胞

本研究创新性开发了搭载组氨酸（pHis）的脂质纳米颗粒（HLNP）递送靶向Gb3合成酶（A4GALT）的小干扰RNA（siRNA），通过微流控技术实现高效包载，利用pHis的质子海绵效应促进内体逃逸。在GLA敲除的人诱导多能干细胞（hiPSC）分化的内皮细胞（EC）和足细胞（PC）模型中，该疗法显著降低Gb3沉积、逆转转录组异常，尤其在内皮细胞中效果更显著，为法布里病（FD）的底物减少疗法（SRT）提供了新策略。

　　

摘要

本研究聚焦法布里病（FD）——一种由GLA基因突变导致α-半乳糖苷酶A（α-Gal A）缺陷的X连锁溶酶体贮积症。团队开发了靶向Gb3合成酶（A4GALT）的siRNA脂质纳米颗粒（HLNP），通过组氨酸（pHis）增强内体逃逸能力，显著改善FD细胞模型的病理表型。

材料与方法

纳米颗粒设计与表征
采用微流控技术制备HLNP，包含离子化脂质（ALC-0315）、PEG脂质（DMG-PEG）、辅助脂质（DSPC）和胆固醇，优化pHis/siRNA重量比至0.2以确保高效包载。动态光散射（DLS）显示HLNP粒径为73.7±12.0 nm，透射电镜（TEM）证实其均一性。

细胞模型构建
通过CRISPR/Cas9敲除hiPSC的GLA基因，分化为内皮细胞（CD31⁺/CD34⁺）和足细胞（podocalyxin⁺/nephrin⁺）。Western blot验证α-Gal A表达缺失，酶活性检测显示α-Gal A活性降至野生型（WT）的0.1%-2.8%。

结果

递送效率与安全性
Cy5.5标记实验显示HLNP在内皮细胞的转染效率达76.2%，显著高于足细胞（48.6%）。浓度≤5 μg/mL时，细胞存活率>90%。电镜观察到HLNP以点状结构定位于胞质。

表型挽救
A4GALT-siRNA-HLNP处理使A4GALT蛋白表达降低60%-77%，Gb3沉积减少72%-75%。电镜下"斑马体"结构消失，提示溶酶体贮积改善。RNA-seq分析显示，内皮细胞中血管生成（如VEGF通路）和氧化应激相关基因表达恢复，而足细胞的细胞外基质相关基因修复较弱。

机制探讨
RT-qPCR证实A4GALT mRNA水平下降70%-80%，内皮标志物（CD31/Flk1）表达部分恢复。差异效应可能源于：①足细胞转染效率低；②终末分化细胞再生能力有限。

讨论

该研究首次将pHis整合到LNP中增强siRNA递送，相比CRISPR/Cas9更具临床转化潜力。局限性包括：①hiPSC模型未能完全模拟体内微环境；②长期安全性待验证。未来需在FD动物模型中评估全身给药效果。

创新点

1. 双机制内体逃逸设计（膜破坏+质子海绵效应）
2. 揭示A4GALT抑制对FD内皮/足细胞的差异修复
3. 提供优于酶替代疗法（ERT）的SRT新方案