染色体表达条形码技术在细菌光学池筛选中的应用：解析84种红色荧光蛋白的成熟动力学

本研究针对细菌光学池筛选中染色体条形码表达的技术瓶颈，开发了基于T7启动子的原位基因分型方法。研究人员通过构建含84种红色荧光蛋白(RFP)的E. coli文库，结合微流控芯片和滚环扩增(RCA)技术，首次实现细菌染色体条形码的原位检测，精确测定了荧光蛋白成熟时间(τm)，为基因组工程和动态表型研究提供了新工具。该成果发表于《Communications Biology》，解决了质粒表达变异干扰表型分析的难题。

　　

在微生物研究中，光学池筛选(optical pooled screening)是连接基因型与表型的关键技术，但长期以来存在一个技术瓶颈：当需要研究染色体定位的基因时，传统依赖质粒表达条形码的方法会因拷贝数变异干扰表型分析。例如研究基因表达噪声或染色体位点标记时，必须将条形码整合到基因组中。红色荧光蛋白(RFP)作为重要标记工具，其缓慢的成熟特性(常超过细菌代时)更会模糊动态过程观测。这些限制严重阻碍了细菌基因组工程和实时表型研究的发展。

针对这一挑战，Uppsala大学等机构的研究团队在《Communications Biology》发表创新性研究。该工作开发了细菌染色体条形码原位检测系统，通过替换lac操纵子的基因工程策略，构建含84种RFP变体的E. coli文库。每个菌株的荧光蛋白开放阅读框(ORF)与独特条形码共整合，后者由T7启动子驱动并辅以RNA稳定元件d0序列增强表达。研究采用"僵尸转录"(zombie transcription)技术，在固定细胞中利用T7 RNA聚合酶原位生成条形码RNA，通过锁式探针(PLP)杂交和滚环扩增(RCA)信号放大，最终用组合荧光原位杂交(FISH)实现单陷阱水平的基因分型。

关键技术包括：(1)λ-Red重组系统构建染色体整合菌株库；(2)微流控"母机"(mother machine)芯片培养实现克隆谱系追踪；(3)氯霉素(CHL)阻断蛋白质合成后监测荧光累积；(4)七轮循环的错配校正解码方案(汉明距离≥3)；(5)双指数函数拟合成熟动力学。样本来源于实验室构建的MG1655工程菌株库。

结果
Phenotyping followed by in situ genotyping
通过微流控芯片捕获4000个单细胞陷阱，在IPTG诱导表达稳态后，用CHL终止蛋白合成并监测荧光增长。如图1B所示，不同RFP表现出显著差异的成熟轨迹，mCherry2-L最快达到荧光平台期，而部分蛋白需>300分钟。原位基因分型显示70-83.7%陷阱成功解码，单轮错误率仅0.038(表1)。

In situ genotyping barcode efficiency
比较NGS与原位检测的频率比(图2)，73/85条形码的检出频率差异<2倍，验证了方法的可靠性。异常条形码如EXP-24-CB5647存在表型异质性(补充表3A)，可能与PLP杂交效率相关。

Scatter plots for the maturation time
图3显示84种RFP的成熟时间(τ_m)与基础荧光强度的三维分布。mScarlet-I亮度最高而mCherry2-L成熟最快，数据在三个重复实验间高度一致(图4)。双指数拟合揭示部分RFP存在光漂白(τ_b)现象，如FusionRed需校正15%信号损失。

Average total cell fluorescence
图5展示代表性RFP的平均荧光动力学曲线，缓慢成熟蛋白(如mScarlet3)在CHL处理后呈现更显著的荧光增长倍数，符合"未成熟蛋白池更大"的理论预期。

结论与意义
该研究首次实现细菌染色体条形码的原位读取，突破了质粒依赖型筛选的技术局限。建立的成熟时间数据库(补充表2)为RFP选择提供定量依据，例如动态过程宜选mCherry2-L(τ_m=24.3±0.7min)，而高灵敏度检测推荐mScarlet-I。方法学创新包括：(1)僵尸转录克服固定细胞RNA保存难题；(2)RCA信号放大使单拷贝染色体条形码可检测；(3)微流控克隆培养消除种群异质性干扰。

这项工作为细菌基因组规模研究开辟了新途径，特别适用于：启动子突变效应分析、染色体位点标记追踪、基因位置对表达的影响等场景。技术框架可扩展至其它微生物体系，为合成生物学和系统微生物学研究提供通用工具平台。