靶向cGAS变构位点的蛋白质凝聚抑制剂设计：通过调控相分离抑制先天免疫反应的新策略

本研究针对cGAS-STING通路过度激活引发的自身免疫疾病，通过结构生物学手段发现cGAS变构位点，设计出XL系列变构抑制剂(XL-3156/XL-3158)。这些蛋白凝聚抑制剂(PCIs)通过稳定激活环(activation loop)的闭合构象，同时抑制cGAS酶活性和cGAS-DNA相分离(LLPS/LSPS)，在急性胰腺炎(AP)模型中展现显著疗效，为开发新型免疫调节药物提供了机制框架。

　　

在先天免疫系统中，环状GMP-AMP合成酶(cGAS)作为关键的DNA感受器，通过cGAS-STING信号通路触发I型干扰素反应。然而，该通路的异常激活与多种疾病密切相关，包括Aicardi-Goutieres综合征、自身免疫性疾病、炎症性疾病、神经退行性疾病和COVID-19等。尽管已有多个cGAS抑制剂被报道，但存在物种特异性抑制活性不足、细胞效力低下等问题，且尚无药物上市。更关键的是，cGAS与DNA结合后会经历液-液相分离(LLPS)，形成生物分子凝聚体，这种独特的相变行为可能影响传统抑制剂的治疗效果。

为解决这些问题，中国科学院上海药物研究所的研究团队在《Nature Communications》发表了一项突破性研究。通过结构生物学和化学生物学手段，发现cGAS上一个全新的变构位点，并据此设计出能同时靶向变构位点和正构位点的蛋白凝聚抑制剂(PCIs)。这些抑制剂不仅能抑制cGAS酶活性，还能调控其相分离过程，在细胞和动物模型中均展现出优异的治疗效果。

研究采用了多项关键技术：1)X射线晶体学解析cGAS与抑制剂的复合物结构；2)电泳迁移率变动分析(EMSA)检测cGAS-DNA相互作用；3)荧光显微技术分析相分离动态；4)分子动力学模拟研究变构调控机制；5)THP-1双报告基因系统评估细胞水平抑制活性；6)小鼠急性胰腺炎模型验证体内疗效。

研究结果部分：

发现cGAS变构位点并设计变构抑制剂

通过解析h-cGAS^CD与RU.521的复合物晶体结构(图1a)，发现(R)-RU.521结合于激活环附近的新位点，该变构位点距离正构位点11.7?。基于此设计出双位点抑制剂XL-3156(图1d)，其结合模式经晶体结构验证，能同时占据变构和正构位点，稳定激活环的闭合构象。

变构抑制剂破坏cGAS-DNA相互作用及相分离

EMSA实验显示XL-3156显著减弱cGAS与DNA结合(图2a)。相分离实验发现，XL-3156处理使cGAS-DNA凝聚体从液-固相分离(LSPS)转变为液-液相分离(LLPS)(图3a)，FRAP分析证实LLPS液滴具有更高流动性(图3b)。DNA凝聚实验测得XL-3156的EC₅₀为783nM，远优于正构抑制剂G150(348nM)(图2e)。

激活环对PCI功能的关键作用

序列比对显示激活环残基高度保守(图4a)。突变研究表明，V218E突变显著削弱PCI效果，而截短激活环(Δloop)则完全消除PCI活性(图4c)。分子动力学模拟证实XL-3156能稳定激活环的闭合构象(图4d)。

结构导向的化合物优化

基于共晶结构指导，将XL-3156的羧基替换为三氟甲基得到XL-3158，其与h-cGAS结合K_d达7.19μM。MD模拟显示XL-3158形成更稳定的氢键网络(图5d)，酶活抑制IC₅₀为11.1μM，细胞水平EC₅₀达11.85μM，与G150(EC₅₀9.78μM)相当(图7c)。

PCI抑制细胞内的cGAS相分离

共聚焦显微镜观察显示，XL-3158显著减少EGFP-h-cGAS^FL与Cy5-DNA的共定位斑点(图6a,b)。FRAP和时间推移成像证实PCI处理后的凝聚体呈现典型LLPS特征(图6c,d)。

PCI的协同效应与体内疗效

XL-3158与G150联用显示协同效应(图7e)。在cerulein诱导的急性胰腺炎模型中，口服XL-3158(25mg/kg)显著改善胰腺病理损伤，降低血清淀粉酶、脂肪酶及炎症因子TNF-α和IL-6水平(图8)。

研究结论与意义：
该研究首次揭示cGAS变构位点的药理价值，开创性地提出"蛋白凝聚抑制剂"(PCI)概念。XL系列化合物通过独特的三重作用机制：1)占据变构位点稳定激活环闭合构象；2)抑制cGAS催化活性；3)调控相分离状态，实现了对cGAS通路的全方位抑制。特别值得注意的是，PCIs通过将cGAS-DNA凝聚体从LSPS转变为LLPS，有效降低局部cGAS浓度，这一发现为理解相分离的 pharmacological modulation提供了新视角。

在转化医学方面，XL-3158展现的跨物种活性(h-cGAS和m-cGAS)和优异体内药效，克服了现有抑制剂如RU.521(仅抑制m-cGAS)和G150(细胞活性差)的局限性。研究建立的"抑制相分离增强细胞效力"策略，不仅适用于cGAS靶点，也为其他相分离相关靶点的药物开发提供了范式参考。这项工作的创新性体现在：变构位点的发现、PCI概念的提出、相分离调控机制的阐明，以及首个小分子PCI的研发，为治疗cGAS相关疾病开辟了新途径。