基于理性设计与AI优化的反向编辑窗口Prime Editor开发及其在细胞治疗中的应用

研究人员针对Prime Editor（PE）编辑范围受限和脱靶效应等问题，开发了反向Prime Editor（rPE）系统。通过蛋白语言模型优化HNH结构域和MMLV逆转录酶，结合环形rpegRNA和La蛋白，实现了3'端高效编辑（效率达44.41%）并提升保真度。该技术成功在T细胞中植入功能增强突变PIK3CDE527G，为基因治疗提供新工具。

　　

基因编辑技术近年来发展迅猛，但传统Prime Editor（PE）存在两大瓶颈：编辑范围局限于RuvC介导的切口位点3'端，且连续单链断裂（SSB）可能引发基因组不稳定。此外，PE在PAM序列邻近区域的编辑效率骤降，限制了其在治疗中的应用。如何扩展编辑窗口、提高保真度，成为领域内亟待解决的难题。

天津医科大学肿瘤医院等单位的研究人员另辟蹊径，开发出反向Prime Editor（rPE）系统。通过将Cas9-H840A替换为Cas9-D10A，并重新设计rpegRNA，成功将编辑窗口转向HNH介导切口位点的5'端。结合AI驱动的蛋白语言模型优化和环形RNA技术，最终构建的erPE7max系统在人类细胞中实现44.41%的编辑效率，且脱靶率低于0.5%。更令人振奋的是，该系统在T细胞中成功植入PIK3CD^E527G功能增强突变，显著提升肿瘤杀伤效果。这项突破性成果发表于《Nature Communications》。

关键技术包括：1）基于ESM框架的HNH结构域和MMLV逆转录酶进化优化；2）环形rpegRNA与La蛋白协同增强系统稳定性；3）PDOs（患者来源类器官）模型验证T细胞治疗效果；4）高通量测序评估16个基因组位点的编辑效率；5）Cas-OFFinder预测脱靶位点。

【设计与构建rPE】
研究人员发现传统PE的编辑方向受RuvC结构域限制，而Cas9-D10A介导的HNH切口可实现反向编辑。通过优化rpegRNA的PBS（10-16nt）和RTT长度，rPE2在FANCF位点效率达16.34%，且indel副产物比PE2减少50%。

【人类细胞中的表征】
在HEK293T、HeLa等细胞系中测试16个位点，rPE2成功实现单碱基替换（1.02-16.99%）和短片段插入缺失。引入ngRNA（nick gRNA）后，rPE3效率提升2.12倍。而erpegRNA（含evopreQ₁结构）使编辑效率平均提高12倍。

【AI优化关键蛋白】
通过ESM-1v等模型筛选出HNH结构域Q826E突变和MMLV RT的T163E/D339E组合，使erPE2max效率提升2.37倍。紧凑型逆转录酶evoRT将系统尺寸缩小30%，保持同等活性。

【环形rpegRNA与La蛋白协同】
将环形RNA与La蛋白整合为erPE7max，在CAF（癌相关成纤维细胞）中效率达44.41%。实验证实La蛋白的中间连接位置对维持RNP复合物稳定性至关重要。

【细胞治疗应用】
在Jurkat细胞中，通过慢病毒递送的split erPE7max实现40.2%的PIK3CD^E527G编辑。与PDOs共培养实验显示，编辑后T细胞诱导肿瘤细胞凋亡率显著提高（p<0.01）。

这项研究通过多维度创新，不仅拓展了PE的编辑范围，更通过AI辅助设计解决了关键酶活性瓶颈。erPE7max系统在保持高保真度的同时突破效率极限，为遗传病治疗和CAR-T细胞改造提供了全新平台。特别是对PIK3CD等免疫相关基因的精准修饰，为肿瘤免疫治疗开辟了新途径。未来通过优化递送系统，该技术有望成为临床基因治疗的利器。