K13-螺旋桨区天冬酰胺插入介导恶性疟原虫多重抗药性的分子机制研究

本研究针对恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)对青蒿素类(ARTs)等抗疟药产生耐药性的重大临床问题，通过CRISPR/Cas9基因编辑技术构建含不同数量天冬酰胺(1N/2N/3N)插入的K13基因修饰株。研究发现3N插入可显著提高环状体存活率(RSA0–3h)，导致对青蒿琥酯(AS)、双氢青蒿素(DHA)等5种药物的交叉耐药，并揭示其通过延长环状体期、缩短滋养体期的发育异常实现耐药。该成果为抗疟耐药监测提供了新分子标记，发表于《International Journal for Parasitology: Drugs and Drug Resistance》。

　　

疟疾至今仍是威胁全球公共卫生的重大传染病，其中恶性疟原虫导致的死亡占疟疾相关死亡的90%。尽管以青蒿素为基础的联合疗法(ACTs)是当前主要治疗手段，但疟原虫已对几乎所有抗疟药产生耐药性，特别是东南亚地区最早报道的青蒿素耐药现象现已扩散至全球。更严峻的是，K13基因（PF3D7_1343700 kelch propeller domain）作为青蒿素耐药的关键分子标记，其突变谱系复杂——目前已发现超过260个非同义突变，但仅有10个被确认为耐药标记。其中，K13螺旋桨区137-142位氨基酸处天冬酰胺(Asn/N)插入突变在亚洲和非洲地区呈现快速传播趋势，中国-缅甸边境2007-2016年间检出率从47.1%飙升至100%。然而，自然界中该突变常伴随其他位点突变共存，其单独作用机制始终是未解之谜。

为破解这一科学难题，来自中国的研究团队在《International Journal for Parasitology: Drugs and Drug Resistance》发表重要成果。研究人员采用CRISPR/Cas9基因编辑系统，以恶性疟原虫3D7标准株为模型，精准构建了K13基因第142位氨基酸后插入1-3个天冬氨酸（1N-3D7、2N-3D7、3N-3D7）的工程化虫株，并通过环状体存活实验(RSA_0–3h)、药物敏感性检测(IC₅₀)、红细胞内发育周期观测等技术体系，首次系统解析了单纯性天冬酰胺插入对抗药性的独立贡献。

主要技术方法
研究团队通过预加载法将CRISPR/Cas9系统质粒转染红细胞，构建含不同天冬酰胺密码子(AAC/AACAAC/AACAATAAT)插入的K13基因修饰株；采用SYBR Green I染色法检测10种抗疟药(包括青蒿素类、萘喹啉等)的半数抑制浓度(IC₅₀)；通过定时血涂片观察红细胞内发育周期变化；利用TaqMan实时定量PCR进行适应性代价分析。

研究结果

3.1 基因修饰株构建
成功获得仅含K13基因142位后1-3个天冬氨酸插入的纯合突变株，经测序验证插入位点准确（含4个同义"shield突变"）。值得注意的是，使用天然密码子AAT构建时失败，改用AAC方获成功，揭示该区域同源重组存在特殊机制。

3.2 抗药性表型分析
RSA_0–3h显示：3N-3D7存活率(3.5%)显著高于1N/2N株(1.43-1.67%)甚至经典耐药突变C580Y-3D7(2.1%)。IC₅₀检测发现：3N插入株对青蒿琥酯(AS)、蒿甲醚(AM)、双氢青蒿素(DHA)、磷酸咯萘啶(PND)和萘喹啉(NQ)均产生耐药，其中对PND的IC₅₀(18.3nM)突破耐药阈值(15nM)；而1N/2N株仅对NQ耐药。

3.3 发育周期异常
3N-3D7呈现独特的"长环短养"表型：环状体期持续9小时（WT-3D7立即进入滋养体期），但滋养体期发育加速；虽裂殖体成熟同步，但每个裂殖体所含裂殖子数减少30%（16.8 vs 24.1个）。

3.4 适应性代价
竞争实验显示3N-3D7在传代30天(15代)后占比降至10%以下，适应性代价达14.88±2.87，显著高于野生型。

3.5 表达调控
RT-qPCR发现3N插入使K13表达量提升2倍，而C580Y突变则降低40%，提示不同耐药突变存在差异调控机制。

结论与意义
该研究首次证实K13螺旋桨区三重复天冬氨酸(3N)插入是恶性疟原虫对青蒿素类、磷酸咯萘啶和萘喹啉产生交叉耐药的关键分子标记。其耐药机制不同于经典KRP区突变：通过延长药物敏感的环状体期、加速耐药性较强的滋养体期，并减少裂殖子产量来实现生存平衡。尽管3N突变导致显著适应性缺陷，但在高强度药物压力下仍可能被选择保留。

该成果为理解K13基因N端功能提供了新视角——传统认为无功能的氨基酸重复区(137-142位)实际参与调控寄生虫发育时序。研究建立的精确基因编辑体系为后续解析其他复杂突变提供了技术范式，所发现的3N分子标记将优化现有耐药监测网络，对指导临床用药组合具有重要价值。值得注意的是，自然界中3N突变的高频出现可能预示着新的耐药传播风险，亟需在疟疾流行区开展针对性监测。