定向进化HIS1样蛋白增强作物对HPPD抑制类除草剂的代谢能力

为解决水稻、小麦等作物对HPPD抑制类除草剂敏感性问题，研究人员通过定向进化策略改造OsHSL2/4/6和SbHSL1蛋白，结合AlphaFold 3模型与晶体结构，系统性设计关键活性位点突变。研究发现OsHSL2-M4、OsHSL4-M5和SbHSL1-M4突变体对BBC-OH、甲基双喹酮等除草剂的代谢活性显著提升，为抗除草剂作物分子育种提供了新靶点与技术路径。

　　

研究背景与意义
在现代农业中，HPPD（4-羟基苯丙酮酸双加氧酶）抑制类除草剂因其高效和环境友好特性被广泛应用。然而，水稻、小麦等重要作物却对这些除草剂表现出天然敏感性，严重限制了其田间使用。2019年，Yuzuru Tozawa团队发现的HIS1基因及其同源基因HSLs为解决问题带来了曙光——HIS1编码的Fe(II)/2-酮戊二酸(2-OG)依赖型双加氧酶可通过羟基化/氧化作用降解β-三酮类除草剂，但天然HSLs的催化活性较弱。如何通过蛋白质工程改造HSLs，使其具备高效代谢HPPD抑制剂的能力，成为抗除草剂作物育种的关键科学问题。

研究方法与技术路线
研究人员选取水稻OsHSL2/4/6和高粱SbHSL1为研究对象，通过AlphaFold 3蛋白预测模型与晶体结构比对，锁定活性口袋关键残基。采用位点特异性突变构建突变体库，利用HPLC检测酶活性，LC-ESI-MS鉴定代谢产物，并结合Michaelis-Menten方程分析催化参数。实验系统包含6种HPPD抑制剂（如BBC-OH、甲基双喹酮）和标准反应体系（含FeCl₂、2-OG等辅因子）。

主要研究结果

HSLs对HPPD抑制剂的代谢活性与工程策略
野生型OsHSL2/4/6和SbHSL1对HPPD抑制剂的代谢效率普遍低于20%。序列比对发现，HIS1活性口袋关键残基（如H141、F205）与HSLs存在显著差异，提示通过定向进化改造这些位点可能提升催化活性。

OsHSL2功能突变体的构建
通过将T206F/F301L/L335R/Y339F四重突变引入OsHSL2，获得的M4突变体对甲基双喹酮的代谢活性提升至原始酶的4.5倍，k_cat/K_m达5.02×10^-2 μM^-1·min^-1。研究发现F301L突变通过减小侧链空间位阻，显著改善底物结合能力。

OsHSL4功能突变体的突破
Y142H/I207F/F303S三重突变体（M5）展现出对吡唑类HPPD抑制剂topramezone的独特代谢能力，可完全降解该除草剂。值得注意的是，当引入L334R突变后（M6），该活性完全丧失，说明α8螺旋的构象变化直接影响吡唑类底物选择性。

SbHSL1突变体的农业应用潜力
Q140H单点突变使SbHSL1对BBC-OH的代谢效率从20.6%跃升至97.7%。LC-ESI-MS证实代谢产物在3-乙酰基-BOD环上发生羟基化，与HIS1作用机制一致。但该酶对已获批用于高粱田的苯喹酮无显著活性，提示需进一步优化。

结论与展望
该研究通过结构引导的定向进化策略，成功将OsHSL2/4和SbHSL1改造为高效HPPD抑制剂代谢酶，其中OsHSL4-M5对吡唑类、SbHSL1-M4对三酮类除草剂的代谢能力达到实用化水平。这些发现不仅揭示了HSLs底物选择性的结构基础（如F303S决定吡唑类特异性），更为设计广谱抗除草剂作物提供了分子模块。未来研究需解析HIS1/HSLs与完整HPPD抑制剂的复合物结构，以指导更精准的蛋白质设计。该成果发表于《Advanced Agrochem》，为减少除草剂使用、推动可持续农业提供了创新解决方案。