酿酒酵母中通过改造α-乙酰乳酸脱羧酶立体选择性实现高效(S)-乙酰丁醇生物合成

针对(S)-乙酰丁醇微生物合成依赖非酶促反应、成本高昂的难题，研究人员通过改造酿酒酵母的α-乙酰乳酸脱羧酶(ALDC)立体选择性，结合PDC通路消除和氧摄取增强策略，首次实现葡萄糖直接发酵生产光学纯度>90%的(S)-乙酰丁醇，为手性药物合成提供了经济高效的生物制造路径。

　　

乙酰丁醇作为一种四碳α-羟基酮类化合物，因其分子中的手性中心存在(R)-和(S)-两种立体异构体，在药物不对称合成领域具有重要价值。尽管微生物合成(R)-乙酰丁醇已较为成熟，但(S)-构型的生产长期面临瓶颈——其生物合成依赖α-乙酰乳酸的非酶促自发脱羧，导致工艺效率低下且需添加昂贵的二乙酰或2,3-丁二醇前体。更棘手的是，现有化学合成法存在毒性风险，而利用全细胞催化体系又面临底物成本高（可达葡萄糖的1000倍）、酶稳定性差等经济性挑战。这种局面严重制约了(S)-乙酰丁醇在制药等领域的规模化应用。

针对这一难题，来自韩国国立研究基金会支持的研究团队在《Bioresource Technology》发表创新成果。研究人员选择酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)作为宿主，通过多维度工程改造，首次建立了完全酶驱动的(S)-乙酰丁醇葡萄糖发酵路径。关键技术包括：1) 消除内源性PDC介导的外消旋途径；2) 对天然偏好(R)-产物的Bacillus subtilis α-乙酰乳酸脱羧酶(Bs.AlsD)进行立体选择性改造；3) 通过遗传增强氧摄取促进中间体转化；4) 使用CEN.PK2-1C工程菌株进行发酵优化。

【Elimination of endogenous racemic acetoin synthesis pathway】
研究首先敲除PDC1/5/6基因阻断内源性外消旋途径，同时保留线粒体Ilv2的(S)-α-乙酰乳酸合成能力。通过比较Δpdc1/5/6菌株与野生型的代谢谱，证实该策略有效消除了非立体选择性副产物。

【Engineering ALDC stereospecificity】
对Bs.AlsD进行理性设计，基于其晶体结构预测关键残基突变体。通过筛选获得F26L/V49I双突变体，其(S)-选择性较野生型提高8.3倍，酶动力学分析显示对(S)-α-乙酰乳酸的K_m值降低至原1/5。

【Oxygen uptake enhancement】
过表达细胞色素c氧化酶(Cox4)和线粒体载体蛋白(Mir1)，使氧消耗率提升2.1倍。此改造显著减少(S)-α-乙酰乳酸积累，副产物2,3-丁二醇生成量降低78%。

【Conclusions】
最终工程菌株在5L发酵罐中实现12.8 g/L的(S)-乙酰丁醇产量，对映体过量值(ee)达93%。该研究突破性地将传统依赖化学前体的多步工艺简化为一步发酵，且无需添加金属离子等辅助因子。立体选择性ALDC的设计策略为其他手性分子生物合成提供了范式，而氧传递工程与代谢通路的协同优化思路，对解决好氧发酵中的氧化还原平衡问题具有普适性指导价值。